先天性膽總管囊腫膽總管上皮緊密連接蛋白表達及其意義

王興東，汪 健，郭萬亮，盛 茂

(蘇州大學附屬兒童醫院 a.病理科，b.普外科，c.影像科，江蘇 蘇州 215003)

先天性膽總管囊腫膽總管上皮緊密連接蛋白表達及其意義

王興東a，汪 健b，郭萬亮c，盛 茂c

(蘇州大學附屬兒童醫院 a.病理科，b.普外科，c.影像科，江蘇 蘇州 215003)

目的 了解先天性膽總管囊腫(congenital choledochal cyst，CCC)膽總管上皮緊密連接蛋白表達是否有改變。方法 收集12例兒童CCC膽總管標本，采用免疫組織化學并結合圖像分析系統，分析兒童CCC膽總管上皮緊密連接相關蛋白水閘蛋白(occludin)、水閘蛋白-1(claudin-1)表達的改變。結果 CCC組的occludin、claudin-1表達圖像分析指標陽性染色得分(MQS)值分別為(44.11±13.824、63)分、(443±23.589)分；對照組分別為(11.298±9.5776)分、(46.098±7.841)分，差異有統計學意義(P= 0.0034，P= 0.0384)。結論 CCC患兒膽總管上皮緊密連接相關蛋白occludin、claudin-1表達增高，提示膽總管上皮屏障破壞。

咬合蛋白；水閘蛋白；先天性膽總管囊腫

先天性膽總管囊腫(congenital choledochal cyst，CCC)好發于嬰幼兒，發病原因尚未完全闡明。一種學說認為在胚胎發育中，膽管由實心向空心演變時，有的節段由于發育緩慢，發生狹窄，近端發生擴張。另一種學說認為是胰膽管合流異常所致[1]。CCC可以發生于任何年齡，10歲以下女性兒童多見，延誤診治可以導致膽囊炎、膽系結石。膽道存在慢性炎癥進一步造成膽道上皮屏障的破壞，并導致膽道上皮細胞增殖核抗原活性增強、P53、K-ras過表達致使膽道上皮惡性轉化[2，3]，但對于CCC膽道上皮屏障破壞后緊密連接相關蛋白表達改變目前尚未見文獻報道。

膽道黏膜屏障功能的解剖基礎源于膽道上皮細胞間的緊密連接，緊密連接主要由緊密連接相關蛋白組成，緊密連接相關蛋白是非均質復合物，包括咬合蛋白(occludin)、水閘蛋白(claudin) 家族、閉鎖小帶蛋白(zonula occludens，ZO)家族、連接黏附分子、扣帶蛋白(cingulin)、偶對蛋白(symplekin) 等[4，5]。occludin 蛋白準確定位于緊密連接處，在維持細胞間的通透性、保持細胞間的跨上皮電阻有重要意義[6]。claudin 各成員在各種組織中的分布以及功能不同，研究表明claudin-1在消化道黏膜屏障中發揮重要作用[7，8]。

Fallon等[9，10]研究證明，肝外膽道膽汁淤積可以導致ZO-1表達增加，occludin表達2天下降，9天后逐步恢復到與對照組同樣水平，然而，Takakuwa 等[11]通過結扎大鼠膽總管6小時后，發現occludin mRNA表達明顯增加。已有關于膽道上皮通透性增加導致膽道上皮損傷的報道[12]，而occludin、claudin-1是膽道上皮屏障中的重要分子，主要分布在在人的膽管和膽小管中[13]，而目前對于CCC膽管上皮損傷后緊密連接相關蛋白表達改變未見相關報道。因此闡明CCC導致膽總管緊密連接相關蛋白表達改變，將有助于了解膽道上皮屏障破壞機制。

1 資料與方法

1.1 一般資料 本研究征得蘇州大學附屬兒童醫院倫理委員會同意，采用回顧性分析方法，收集蘇州大學附屬兒童醫院2011～2014年經過影像學檢查、手術和病理證實的CCC患兒共12例，男7例，女5例，年齡5月至8歲，中位年齡3歲。收集患者膽總管囊腫標本，采用免疫組織化學SP法進行膽總管緊密連接蛋白occludin、claudin-1染色。對照組來源于我院新生兒或兒童死亡病例膽總管標本，胎齡1天至8歲，中位胎齡為5天。

1.2 方法 ①免疫組化染色：采用SP法。將石蠟包埋的組織連續5 μm切片，切片脫蠟至水，3% H2O2室溫孵育30 min 滅活內源性過氧化物酶，蒸餾水沖洗，PBS 浸泡，pH 6.0 枸櫞酸鹽緩沖液微波爐抗原修復，10%山羊血清封閉非特異性染色。滴加不同比例稀釋的一抗occludin(1∶300) (Abcam，Inc.UK)、claudin-1(1∶250)(Abcam，Inc.UK)，置于4 ℃冰箱過夜后在37 ℃水浴恒溫箱復溫45分鐘。加生物素標記二抗，在37 ℃水浴恒溫箱反應20分鐘； 再加辣根酶標記的鏈霉卵白素，在37 ℃水浴恒溫箱反應20分鐘，PBS沖洗4次，每次5 min。DAB-H2O2顯色，蘇木素淡復染，常規脫水，透明，封片。實驗陽性對照由Abcam，Inc(UK)提供的陽性對照片，染色后均為陽性；膽總管上皮細胞柱狀，細胞膜呈棕褐色為陽性，在免疫組化中，以PBS液代替一抗作陰性對照，結果均為陰性。②免疫組化圖像分析：采用IPP 6.0 圖像分析軟件定量分析免疫組化染色情況。為了客觀分析occludin、claudin-1免疫組化陽性染色的數量和分布，將所有免疫組化染色切片置于顯微鏡下，采用IPP 6.0圖像分析系統。在400倍視野下，每張切片于膽管上皮陽性表達處選擇5～8個視野進行拍片，然后保存在計算機上，進行專業圖像分析。圖像分析選擇的指標參照Mady等[14]的方法，計算陽性染色得分(Mean qualifying score，MQS)，即陽性染色比例與陽性表達處平均光密度乘積。將每個切片所選擇的視野拍片并經過圖像分析后，所得數值取平均值后即為該患者的分析指標值。

1.3 統計學方法 采用SAS V8.1統計軟件進行數據處理。觀察指標采用均數±標準差表示，根據資料分布和方差齊性檢驗，對于不能滿足t檢驗的，采用Wilcoxon法檢驗，P< 0.05為差異有統計學意義。

2 結果

免疫組織化學染色圖像分析結果顯示，膽總管上皮細胞呈柱狀，claudin-1主要呈細胞膜表達，部分細胞質核和細胞核呈弱陽性表達(圖1)。CCC組中claudin-1表達圖像分析指標值MQS高于對照組，差異有統計學意義(P= 0.0384)。occludin主要在細胞膜表達，呈中等程度表達，細胞質及細胞核無明顯陽性表達(圖2)。CCC組中occludin表達圖像分析指標值MQ高于對照組差異有統計學意義(P= 0.0034)，見表1。

圖1 claudin-1免疫組化染色圖象 claudin-1主要呈細胞膜高表達，部分細胞質核和細胞核呈弱陽性表達

圖2 occludin免疫組化染色圖像 occludin于細胞膜呈中等程度表達

組別occlindinclaudin-1CCC組(n=12)44.11±13.82463.443±23.589對照組(n=10)11.298±9.577646.098±7.841Z-3.2978-2.2089P0.00340.0384

3 討論

緊密連接是使緊靠在一起的相鄰細胞形成環繞的物質屏障結構，具有細胞粘附、維持細胞極性和選擇性通透性作用[6，7]。膽管上皮存在緊密連接分子occludin、claudins等構成膽管上皮屏障，將機體與膽道內的外源性物質隔離開來，避免有毒物質和病原微生物的侵襲和炎癥因子的損傷[10，11，15，16]。但CCC膽總管上皮屏障相關蛋白及其表達改變目前未見相關報道。

我們的實驗發現，CCC膽總管中occludin、claudin1表達增高，與對照組相比差異有統計學意義，結果表明，CCC患者膽總管上皮緊密連接遭到破壞，屏障功能紊亂。Rahner 等通過結扎大鼠膽總管后，觀察緊密連接結構與功能及膽汁淤積的關系，其研究結果表明，膽汁淤積程度與緊密連接完整性損傷相關[17]。此外，Fallon等[9，10]通過結扎大鼠膽總管后，結果發現occludin分布發生改變。Takakuwa等[11]通過結扎大鼠膽總管后，發現occludin mRNA表達明顯增加，而claudin1-2表達未受影響。以上研究表明膽汁淤積對于緊密連接蛋白表達和分布有影響。而本組資料中CCC患者膽總管遠端合并痙攣，與膽道梗阻病理改變相類似，提示膽道上皮屏障功能受損，從而表現為膽道緊密連接蛋白表達的改變。而本研究中claudin-1表達升高，實驗結果提示CCC引起的病理改變不單純是膽汁淤積的問題，緊密連接蛋白的改變可能與CCC合并胰膽管合流異常所致胰液反流有一定關系。研究表明毒素和藥物也可以影響膽管屏障功能，可以導致膽管上皮滲透性增加[18]。而CCC合并胰膽管合流異常患者中，由于胰液的返流，其內大分子物質具有很強的毒性，從而可以導致膽管屏障功能的損傷。膽管屏障受損致膽汁成分進入膽道、肝臟間質組織，膽汁誘發的細胞損傷參與膽道疾病發生。已有證據顯示膽道疾病的發病與膽道緊密連接和膽管功能有關[2，12]。

總之，本研究對CCC患兒膽總管緊密連接蛋白進行了分析，實驗結果顯示，隨著CCC患兒膽總管上皮屏障緊密連接蛋白分子表達增高，膽總管上皮屏障受損；緊密連接蛋白受到多種信號通路動態調節，多種上皮細胞損傷因素通過激活多種細胞內信號通路來損傷上皮屏障。但CCC膽道上皮受損的具體機制尚需進一步研究。

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Expression and significance of tight-junction associated protein in the common bile duct in pediatric patients with congenital choledochal cyst

WANG Xing-donga，WANG Jianb，GUO Wan-liangc，SHENG Maoc

(a.Department of Pathology，b.General Surgery Department，c.Radiology Department，Children’s Hospital of Soochow University，Suzhou 215003，China)

WANGJian

Objective The aim of this study was to investigate the alteration of tight junction-associated protein expression in the epithelium of common bile duct in pediatric patients with congenital choledochal cyst (CCC).Methods The common bile duct specimens were collected from 12 pediatric patients with CCC.The expression of the tight junction-associated protein related protein occludin and claudin-1 was determined by using immunohistochemistry and image processing system.Results Immunohistochemistry showed that the mean quick scores (MQSs) for occludin and claudin-1 were (44.11 ±13.824) and (63.443 ± 23.589)，respectively，which were significantly higher than those in the controls [occluding：(11.298 ± 9.5776) and claudin-1：(46.098±7.841)，P= 0.0034 and 0.0384，respectively].Conclusion The expression of tight junction-associated proteins occludin and claudin-1 is elevated in the epithelium of common bile duct in pediatric patients with CCC.This indicates that there is the development of disruption in common bile duct epithelial barrier.

Occludin； Claudin-1； Congenital choledochal cyst

江蘇省社會發展—重點病種規范化診療項目(編號：BE-2015643)，江蘇省衛生計生委科研資助項目(編號：H201520)，蘇州市應用基礎研究項目(編號：SYS201563)

汪健，男，博士，博士生導師，教授。江蘇省重點學科“兒科學”首席學科帶頭人。主要研究方向：兒童消化道畸形臨床與基礎研究。

R726.1

A

1672-6170(2016)04-0017-03

2016-04-15；

2016-04-20)