神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠的實驗研究

張東利黑龍江省醫(yī)院急救中心，黑龍江哈爾濱　150000

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神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠的實驗研究

張東利
黑龍江省醫(yī)院急救中心，黑龍江哈爾濱150000

［摘要］目的研究神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠的臨床效果。方法選擇年齡在12個月左右的60只健康成年Wistar大鼠作為該次實驗對象，實驗時間為2015年5—10月，大鼠的體重均在300～400 g左右，用于制備血管性癡呆2VO模型，將大鼠隨機分成3組，分別為假手術(shù)組、對照組及NSCs組，在移植前后對3組大鼠實施Morris水迷測試。結(jié)果移植后5周、10周時，NSCs組大鼠逃避潛伏期（36.85±7.14）、（40.26±8.11）相對于對照組（52.11±6.57）、（54.10± 7.16）有了顯著的減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。結(jié)論針對VaD大鼠模型采用神經(jīng)干細胞移植的效果顯著，能有效改善大鼠學習記憶能力。

［關(guān)鍵詞］神經(jīng)干細胞移植；血管性癡呆；實驗研究

血管性癡呆是指由出血性卒中、缺血性卒中及造成認知、行為及記憶等腦區(qū)低灌注的腦血管疾病所致的嚴重認知功能障礙綜合征，主要發(fā)生原因與腦缺氧、出血性病變、感染因素、家族史及其他因素有關(guān)，臨床癥狀主要表現(xiàn)為焦慮、眼花、猜疑、認知功能障礙及易激惹等，嚴重影響患者的生活質(zhì)量，增加患者家庭的經(jīng)濟及精神負擔，若不及時治療，將會導致抑郁癥、自主神經(jīng)功能紊亂及肺部感染尿路感染等疾病出現(xiàn)。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選擇年齡在12個月左右的60只健康成年Wistar大鼠作為該實驗對象，實驗時間為2015年5—10月，大鼠的體重均在300～400 g左右，用于制備血管性癡呆2VO模型，將大鼠隨機分成3組，分別為假手術(shù)組、對照組及神經(jīng)干細胞移植組，每組各20只，假手術(shù)組大鼠月齡為10～15個月，平均月齡為（12.50±1.31）個月，體重300～450 g，平均體重為（385.12±25.64）g；對照組大鼠月齡為10～14個月，平均月齡為（12.38±1.29）個月，體重300～420 g，平均體重為（385.10±25.38）g；神經(jīng)干細胞移植組大鼠月齡為10～13個月，平均月齡為（12.23± 1.28）個月，體重300～410 g，平均體重為（383.10±25.10）g。對比3組大鼠臨床資料發(fā)現(xiàn)，差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05），組間具有可比性。

1.2 方法

對照組20只在模型建立成功后一個月海馬立體定位注射10 uL生理鹽水。NSCs組在VaD模型造模成功后1個月海馬立體定位注射10 uL NSCs液。進行原代培養(yǎng)Wistar大鼠神經(jīng)干細胞球，傳代至第6代后，將慢病毒介導GFP轉(zhuǎn)染后移植備用。給予10%水合氯醛進行麻醉，剔除頸部毛發(fā)，將頸部皮膚充分暴露，常規(guī)消毒，于胸骨上方正中處作一2 cm左右的切口，將皮下組織、肌肉鈍性分離，充分暴露神經(jīng)、血管，將迷走神經(jīng)及頸總動脈采用玻鉤進行分離，于頸總動脈上1/3處用手術(shù)線在近心端與遠心端結(jié)扎，阻斷血流，離斷頸總動脈，在結(jié)扎另一側(cè)頸總動脈，撒上頭孢唑林鈉粉，避免感染現(xiàn)象，最后縫合傷口，注射頭孢唑林鈉。

假手術(shù)組采用常規(guī)麻醉后，切開皮膚，將雙側(cè)頸總動脈暴露出來，無需結(jié)扎血管，海馬立體定位注射10ul生理鹽水。假手術(shù)組手術(shù)方式與NSCs組一致，但注意其對雙側(cè)頸動脈不實施結(jié)扎操作；常規(guī)麻醉后，NSCs組在VaD模型造模成功后1個月海馬立體定位注射10 uL NSCs液，在注射點相應顱骨上鉆孔，吸入15 uL待移植細胞，在海馬內(nèi)注射NSCs液，一側(cè)注射量為5 uL，將注射速度控制在1 uL/min內(nèi)，留針5 min，采用明膠海綿將顱孔進行封閉，最后縫合皮膚。移植1周后，將NSCs組及對照組大鼠處死并迅速將其大腦取出，進行冰凍切片，在熒光顯微鏡下對大腦切片海馬區(qū)進行觀察。

1.3 統(tǒng)計方法

采用SPSS 20.0軟件對3組Wistar大鼠的各項觀察指標情況進行統(tǒng)計學處理。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，并采用t檢驗，計數(shù)資料采用（n，%）表示，采用X2檢驗。

2 結(jié)果

神經(jīng)干細胞通過海馬立體注射后7 d，NSCs組大鼠海馬區(qū)冰凍切片呈現(xiàn)綠色熒光出現(xiàn)，對照組大鼠腦組織切片在鏡下未出現(xiàn)熒光，由此可知，神經(jīng)干細胞移植7 d后，在海馬區(qū)域存在存活及增殖現(xiàn)象。移植后5周、10周時，NSCs組大鼠逃避潛伏期相對于對照組有了顯著的減少，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；NSCs組穿越平臺區(qū)次數(shù)相對于對照組有明顯的增加，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）；但相對于假手術(shù)組各種觀察指標的差異，差異有統(tǒng)計學意義（P＜0.05）。見表1。

表1 對比3組大鼠逃避潛伏期(±s）

表1 對比3組大鼠逃避潛伏期(±s）

注：假手術(shù)組與對照組：T移植前=16.716，P=0.000；T移植1周= 12.119，P=0.000；T移植2周=15.048，P=0.000；T移植10周=13.183，P= 0.000；NSCs組與對照組：T移植前=0.245，P=0.8077；T移植1周=5.568，P=0.000；T移植5周=7.034，P=0.000；T移植10周=5.721，P=0.000；假手術(shù)組與NSCs組：T移植前=17.627，P=0.000；T移植1周=7.675，P=0.000；T移植5周=6.647，P=0.000；T移植10周=6.239，P=0.000。

假手術(shù)組（n=20）對照組（n=20）NSCs組（n=20）組別20.13±5.58 50.16±5.78 49.74±5.03移植前21.36±6.24 49.63±8.36 36.59±6.31移植1周23.58±5.36 52.11±6.57 36.85±7.14 25.89±6.35 54.10±7.16 40.26±8.11移植5周　 移植10周

3 討論

尼氏體屬于胞質(zhì)內(nèi)一種嗜堿性物質(zhì)，常見于各種神經(jīng)元內(nèi)，是神經(jīng)元的特征性結(jié)構(gòu)之一［1］，其主要功能是為機體合成蛋白質(zhì)，染色后呈現(xiàn)藍紫色，常用于顯示腦或脊髓的基本神經(jīng)結(jié)構(gòu)，尼氏體數(shù)量較多說明神經(jīng)細胞合成蛋白質(zhì)的功能較強，神經(jīng)細胞受損時，尼氏體數(shù)量減少，甚至消失［2］。移植神經(jīng)干細胞的方式主要包括尾靜脈注射、腦實質(zhì)立體定向注射、腰穿蛛網(wǎng)膜下腔注射、頸動脈注射等［3］，動脈注射具有一定的優(yōu)勢，動脈移植途徑細胞經(jīng)由頸外動脈注射入梗塞側(cè)頸內(nèi)動脈，隨著血流分布于患側(cè)大腦內(nèi)，具有較高的細胞濃度［4］。

大腦邊緣系統(tǒng)主要為海馬，大腦皮層的功能區(qū)參與了空間參考記憶存儲［5］，海馬是記憶存儲的重要結(jié)構(gòu)，能將短時記憶轉(zhuǎn)化為長時記憶，而后進行記憶鞏固，海馬對于缺氧缺血敏感性較高［6］，一旦大腦出現(xiàn)缺氧及缺血，海馬區(qū)的神經(jīng)元會出現(xiàn)壞死現(xiàn)象，導致認知功能發(fā)生障礙，對大鼠海馬立體注射慢病毒介導GFP標記后及NSCs，在切片固定后將熒光顯微鏡倒置觀察到存在大量移植后干細胞在海馬區(qū)存活［7］。胡蘭蘭等［8］在骨髓間充質(zhì)干細胞輸注對血管性癡呆大鼠海馬細胞凋亡的影響一文中指出：“海馬CA1區(qū)神經(jīng)細胞出現(xiàn)凋亡，直接影響信息的回憶及貯存，導致學習記憶功能出現(xiàn)障礙，若能保護大鼠海馬神經(jīng)細胞，減少腦組織凋亡細胞的比例，就能起到保護因缺血、缺氧引起的學習及記憶能力減退現(xiàn)象。”這一研究結(jié)果與該文一致。文章中主要對細胞移植對VaD大鼠學習記憶的影響進行了觀察，結(jié)果得出：術(shù)后8周治療組評分（70.6±4.7）%明顯優(yōu)于模型組（43.6±3.6）%，，兩組術(shù)前評分（91.1±4.4）%、（92.5±5.3）%不存在差異，術(shù)后2周、術(shù)后4周及術(shù)后8周均存在顯著差異（P＜0.05）；與該文中的實驗結(jié)果相符。

綜上所述，神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠的臨床效果明顯，能有效改善及提高血管性癡呆大鼠學習記憶能力，保護腦內(nèi)與學習記憶緊密相關(guān)的海馬神經(jīng)元。

［參考文獻］

［1］孫桂芳.神經(jīng)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠的研究［D］.鄭州：鄭州大學，2014.

［2］胡蘭蘭，姚永杰，蘇長雨，等.骨髓間充質(zhì)干細胞輸注對血管性癡呆大鼠海馬細胞凋亡的影響［J］.中華老年心腦血管病雜志，2014，16（11）：1212-1214.

［3］李麗杰.骨髓間充質(zhì)干細胞移植治療血管性癡呆大鼠的實驗研究［D］.天津：天津醫(yī)科大學，2011.

［4］井沆，肖雁，官志忠，等.骨髓間充質(zhì)干細胞移植至血管性癡呆大鼠模型的初步研究［J］.貴陽醫(yī)學院學報，2014，39（2）：148-153，161.

［5］陳志.骨髓間充質(zhì)干細胞移植對血管性癡呆模型大鼠腦源性神經(jīng)生長因子的影響［D］.南寧：廣西醫(yī)科大學，2010.

［6］農(nóng)偉東，莫雪安，陽玉群，等.甘露醇對骨髓間充質(zhì)干細胞治療血管性癡呆大鼠行為學及海馬CA3區(qū)突觸素表達水平的影響［J］.中華神經(jīng)科雜志，2013，46（6）：408-413.

［7］馬向薇.胚胎干細胞移植治療腦血管疾病［J］.中國組織工程研究，2013，16（31）：5717-5722.

［8］胡蘭蘭，姚永杰，蘇長雨，等.骨髓間充質(zhì)干細胞輸注對血管性癡呆大鼠海馬細胞凋亡的影響［J］.中華老年心腦血管病雜志，2014，16（11）：1212-1214.

Experimental Research of Neural Stem Cells Transplantation？in Treatment of Rats with Vascular Dementia

ZHANG Dong-li
UCC，Heilongjiang Hospital，Harbin，Heilongjiang Province，150000 China

［Abstract］Objective To research the clinical effect of neural stem cells transplantation in treatment of rats with vascular dementia. Methods 60 healthy adult Wistar rats whose weight were between 300～400 g and whose ages were about 12 months were selected as the experimental object，and the experimental time was from May 2015 to October 2015，and they were used to prepare vascular dementia 2VO models and randomly divided into the sham-operated group，control group and NSCs group，and the three groups were tested by Morris water maze task before and after transplantation. Results The escape latent periods of rats in the NSCs group obviously decreased at the 5 weeks and 10 weeks after transplantation compared with those in the control group with statistical significance［（36.85±7.14），（40.26±8.11）vs（52.11±6.57），（54.10±7.16）］（P＜0.05）. Conclusion The effect of neural stem cells transplantation for VaD rat models is prominent，which can effectively improve the learning and memory abilities of rats.

［Key words］Neural stem cells transplantation；Vascular dementia；Experimental research

［中圖分類號］R749.13

［文獻標識碼］A

［文章編號］1674-0742（2016）04（a）-0056-02

［作者簡介］張東利（1979.5-），男，黑龍江人，本科，主治醫(yī)師，主要從事神經(jīng)內(nèi)科血管性癡呆方面疾病的診治工作。

DOI：10.16662/j.cnki.1674-0742.2016.10.056

收稿日期：（2016-01-03）