尼古丁抑制MIA誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡

韓貴賓，張 壽，孫薇薇，鐘海波，陳建強，范忠誠（海口市人民醫院骨科中心，海口 570208）

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尼古丁抑制MIA誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡

韓貴賓，張 壽，孫薇薇，鐘海波，陳建強，范忠誠
（海口市人民醫院骨科中心，海口 570208）

【摘要】目的 探討尼古丁抑制碘乙酸鈉（MIA）誘導的骨關節炎軟骨細胞凋亡。方法 酶消化法分離大鼠原代軟骨細胞，并用10－8，10－7，10－6，10－5mol/ L尼古丁處理細胞48 h，隨后實驗分為5組，除正常組外，其余4組皆用4 μM MIA處理24 h，并給予尼古丁。MTT法檢測各組軟骨細胞活力；Annexin V-FITC/ PI流式雙染細胞術檢測各組軟骨細胞凋亡；分光光度法檢測各組軟骨細胞中含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶（Caspase 3）活性；Western blot分析磷脂酰肌醇3激酶（PI3K）/蛋白激酶B（AKT）激活狀況及下游靶分子Bax，Bcl-2的表達情況。結果10－7，10－6mol/ L尼古丁顯著促進大鼠軟骨細胞活力（P＜0. 05），10－5mol/ L尼古丁顯著降低大鼠軟骨細胞活力（P＜0. 05），10－8mol/ L尼古丁對大鼠軟骨細胞活力無影響（P＞0. 05）。10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能劑量依賴性的提高MIA誘導的大鼠軟骨細胞活力，并抑制MIA誘導的大鼠軟骨細胞凋亡及Caspase 3活性（P＜0. 05）；10－7，10－6mol/ L尼古丁能提高PI3K表達及AKT磷酸化水平，并下調促Bax表達，上調Bcl-2表達（P＜0. 05）。結論 一定劑量尼古丁能顯著的抑制MIA誘導的大鼠軟骨細胞凋亡，可能與PI3K/ AKT信號通路有關。

【關鍵詞】關鍵詞尼古丁；骨關節炎；軟骨細胞；凋亡

骨關節炎（osteoarthritis，OA）是一種慢性退行性骨關節疾病，其中軟骨病變是骨關節炎的中心環節［1］。軟骨細胞是軟骨中唯一細胞結構，一旦軟骨細胞死亡，只能緩慢再生甚至無法再生，而軟骨細胞的死亡又破壞了胞外基質合成及降解的平衡，從而進一步加劇OA［2］。軟骨細胞的凋亡受多種信號通路調節，其中包括PI3K/ AKT，此通路的持續激活，能使軟骨細胞維持增殖活力，并調節下游靶基因Bax，Bcl-2及Caspase 3的表達［3］。

一定劑量尼古丁能顯著促進包括軟骨細胞在內的多種細胞的增殖活力。如Liu等［4］報道在碘乙酸鈉（MIA）誘導的骨關節炎大鼠中，尼古丁通過與乙酰膽堿受體α7結合，從而改善大鼠大體及病理形態，并抑制大鼠軟骨細胞凋亡。Zheng等［5］通過MTT及DAPI實驗證實10－7M尼古丁能顯著抑制白介素-1β（IL-1β）誘導的大鼠軟骨細胞凋亡。但尼古丁對于軟骨細胞凋亡的抑制作用機制尚未見報道，因此本文旨在考察尼古丁是否能過通過PI3K/ AKT信號通路從而阻斷MIA誘導的軟骨細胞凋亡。

1　材料和方法

1.1藥品和試劑

尼古丁購自美國sigma公司，批號：4408；兔抗Bax，Bcl-2，PI3K，AKT，p-AKT，GDAPH抗體購自Epitmics公司；Annexin V-FITC/ PI流式雙染細胞，Caspase 3檢測試劑盒購自南京凱基生物技術有限公司；胎牛血清，DMEM/ F-12培養基，二型膠原酶，四甲基偶氮唑鹽（MTT）購自Gibco公司。

1.2大鼠軟骨細胞的制備［6］

無菌環境下，刮取100 g左右SD大鼠（購于上海斯萊克實驗動物有限公司【SCXK（滬2012－ 0002】）雙側膝關節脛骨坪、髕骨內側透明軟骨，剪碎至1 mm3大小。依次用0. 25%的胰蛋白酶及0. 2%的膠原酶消化。得到單細胞懸液，用DMEM/ F-12培養基重懸細胞（含20%胎牛血清，100 U/ mL青霉素，100 U/ mL鏈霉素），在37℃和5%CO2培養箱中培養，約5～6 d細胞開始融合，實驗使用第2～3代細胞。

1.3軟骨細胞活力檢測（MTT法）

將第2～3代軟骨細胞進行消化，并調整細胞濃度為1×105個細胞/ mL，接種，于37℃和5%CO2培養箱中培養24 h。加入含5%胎牛血清的DMEM/ F-12（含4 μmol/ L MIA及10－8，10－7，10－6，10－5mol/ L尼古丁）培養基，繼續培養24 h，每孔加MTT（5 mg/ mL）20 μL，4 h后，棄上清，并每孔加入DMSO 150 μL，10 min后，酶標儀570 nm處測定OD值，以OD值代表細胞活力。

1.4Annexin V-FITC流式細胞法檢測軟骨細胞凋亡

將第2～3代軟骨細胞進行消化，調整細胞濃度為2×105個細胞/ mL，接種，于37℃和5%CO2培養箱中培養24 h。加入含5%胎牛血清的DMEM/ F-12培養基、尼古丁（終濃度為10－8，10－7，10－6mol/ L）和MIA（終濃度為4 μmol/ L），繼續培養48 h后，按照Annexin V-FITC/ PI細胞凋亡檢測試劑盒說明書的方法，用0. 25%的胰蛋白酶（不含EDTA）消化，PBS洗滌，2000 r/ min離心5 min，收集細胞；加入Binding Buffer 500 μL懸浮細胞，隨后加入Annexin V-FITC 5 μL混勻后，加入PI 5 μL，混勻，于室溫避光反應5～15 min，在1 h內進行流式細胞儀檢測。

1.5Caspase 3活性檢測

將第2～3代軟骨細胞進行消化，調整細胞濃度為2×105個細胞/ mL，接種，于37℃和5%CO2培養箱中培養24 h。加入含5%小牛血清的DMEM/ F-12培養基、尼古丁（終濃度為10－8，10－7，10－6mol/ L）和MIA（終濃度為4 μmol/ L），繼續培養48 h。按Caspase 3分光光度法檢測試劑盒進行檢測。

1.6Western blotting

收集處理過的樣本，加入裂解液裂解，離心，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。蛋白上樣，跑SDS凝膠電泳，轉膜，封閉，加入一抗4℃孵育過夜。次日加二抗孵育后曝光。用“Quantity One”軟件對各蛋白條帶灰度值進行統計。

1.7統計學分析

2　結果

2.1尼古丁對大鼠軟骨細胞活力的影響

如圖1所示，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著提高軟骨細胞活力，差異具有統計學意義（P＜0. 01）；而10－5mol/ L尼古丁對軟骨細胞活力具有顯著抑制作用，差異具有統計學意義（P＜0. 01）；10－8mol/ L尼古丁對軟骨細胞活力影響不大（P＞0. 05）。

圖1　尼古丁對大鼠軟骨細胞活力的影響Note：Compared with normal control group，aaP＜0. 01.Fig. 1 Effect of nicotine on rat chondrocytes viability

2.2尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞活力的影響

如圖2所示，4 μmol/ L MIA顯著抑制軟骨細胞活力，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著提高MIA誘導的軟骨細胞活力，差異均具有統計學意義（P＜0. 01）。

2.3尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞凋亡的影響

如圖3所示，4 μmol/ L MIA顯著促進軟骨細胞凋亡，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著抑制MIA誘導的軟骨細胞凋亡。

2.4尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞PI3K/ AKT信號通路的影響

如圖4所示，4 μmol/ L MIA顯著抑制PI3K表達和AKT的磷酸化程度，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能提高PI3K表達，10－7，10－6mol/ L尼古丁能提高AKT磷酸化水平，差異均具有統計學意義（P＜0. 05）。

2.5尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞Bax及Bcl-2表達的影響

如圖5所示，4 μmol/ L MIA顯著提高Bax表達，抑制Bcl-2表達，而10－7，10－6mol/ L尼古丁能下調Bax表達，上調Bcl-2表達，差異均具有統計學意義（P＜0. 01）。

圖2　尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞活力的影響Note：Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01.Fig. 2 Effect of nicotine on viability of ratchondrocytes induced by MIA

2.6尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞Caspase 3活性的影響

如圖6所示，4 μmol/ L MIA顯著提高軟骨細胞Caspase 3活性，而10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著抑制MIA誘導的軟骨細胞Caspase 3活性，差異均具有統計學意義（P＜0. 01）。

3　結論

Ying等［7］研究結果表明10－7，10－6mol/ L尼古丁能促進骨髓干細胞增殖并向軟骨細胞分化，并隨著時間延長能逐漸誘導二型膠原蛋白的表達，而10－5mol/ L尼古丁可顯著的抑制骨髓干細胞增殖。Schraufstatter等［8］報道10－5mol/ L尼古丁會導致人間充質干細胞的凋亡。說明不同劑量尼古丁對細胞增殖活力影響具有顯著差異，本實驗研究表明10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著提高軟骨細胞活力，而10－5mol/ L尼古丁對軟骨細胞活力具有顯著抑制作用，與上述報道一致，說明在一定濃度范圍內尼古丁對大鼠軟骨細胞增殖具有顯著促進作用。而多種因素可引起軟骨細胞損傷乃至死亡，如軟骨表面應力異常，細胞因子（如IL-1β、TNF-α等）的作用，NO、能量代謝抑制劑（如MIA）等。其中MIA為糖酵解途徑中3-磷酸甘油醛脫氫酶抑制劑，通過抑制細胞能量代謝而導致細胞因供養不足而死亡［9］。MIA體外刺激24 h，亦能造成大鼠軟骨細胞的死亡［10－11］。本實驗亦表明MIA誘導24 h會降低軟骨細胞活力，并使細胞凋亡顯著。且10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁能顯著抑制MIA誘導的細胞凋亡作用，與Zheng等［5］觀點一致。

圖3　尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞凋亡的影響Note：Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01. A：normal control group；B：model group；C：10－8mol/ L nicotine +4 μmol/ L MIA；D：10－7mol/ L nicotine +4 μmol/ L MIA；E：10－6mol/ L nicotine +4 μmol/ L MIA.Fig. 3 Effect of nicotine on apoptosis of rat chondrocytes induced by MIA

正常生理狀態下，關節軟骨細胞凋亡與增殖處于動態平衡，而在OA等病理狀態下，軟骨細胞凋亡占主要方面，且關節軟骨細胞凋亡的異常會引起OA。PI3K/ AKT信號通路在OA軟骨細胞凋亡的發生發展過程中起著重要的作用［3］。PI3K是一種胞內磷脂酰肌醇激酶，具有脂類激酶活性和蛋白激酶活性，其代謝產物4，5-二磷酸磷脂酰肌醇（PIP2）和1，4，5-三磷酸肌醇（PIP3）可以激活AKT蛋白上的絲氨酸或蘇氨酸磷酸化位點，從而調節細胞增殖和凋亡相關基因的表達。PI3K/ AKT信號通路調節眾多靶分子表達，如Bax，Bcl-2，Caspase 3等，調節軟骨細胞凋亡活動［3］。PI3K抑制劑LY294002加入到大鼠脛骨軟骨細胞中，使軟骨細胞凋亡數目增多，且軟骨細胞生長緩慢［12］。胰島素生長因子-1通過激活兔軟骨細胞PI3K/ AKT信號通路拮抗軟骨細胞凋亡，而PI3K抑制劑LY294002加入使軟骨細胞凋亡數目增加［13］。這些提示PI3K/ AKT途徑是抗軟骨細胞凋亡作用的重要途徑。并且李舒潔等［14］研究表明，MIA促使大鼠軟骨細胞凋亡的同時，伴隨著AKT磷酸化水平的降低，Bax表達量的提高及Bcl-2表達量的降低。本研究也發現，在MIA誘導的OA軟骨細胞中，PI3K表達及AKT磷酸化程度下降，而10－7，10－6mol/ L尼古丁顯著促進PI3K表達及AKT磷酸化。Nishioka等［15］研究結果也表明尼古丁可通過激活PI3K/ Akt信號通路來抵抗肺癌細胞凋亡。說明尼古丁可通過PI3K/ AKT信號通路來抵抗MIA誘導的軟骨細胞凋亡。

軟骨細胞的凋亡受凋亡基因的嚴格控制，如Bcl-2家族，能與Bax亞家族成員，相互作用，啟動軟骨細胞內的凋亡信號轉導。在關節炎患者血清中，Bax含量顯著上升，Bcl-2含量下降［16］，通過上調Bcl-2表達，下調Bax表達，能顯著抑制軟骨細胞凋亡［17］，本研究結果也顯示MIA能上調軟骨細胞的Bax表達，下調Bcl-2表達，而10－7，10－6mol/ L尼古丁減弱MIA誘導的這種變化。Caspase是一類進化上保守的天冬氨酸蛋白酶家族，依賴Caspase的信號途徑是細胞凋亡的主要途徑。Caspase 3抑制劑Z-DEVD-FMK或Ac-DMQD-CHO在體外證實能抑制由膠原酶引起的軟骨細胞凋亡［18］。碘乙酸鈉能誘導大鼠軟骨細胞凋亡，與促進Caspase 3的活化有關［19］。本研究發現，在MIA誘導的軟骨細胞中Caspase 3活性顯著提高，10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁可顯著降低Caspase 3活性。

圖4　尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞PI3K/ AKT信號通路的影響與正常組比較，aaP＜0. 05；與模型組比較，bbP＜0. 01Fig. 4 Effect of nicotine on PI3K/ AKT signal pathway in rat chondrocytes induced by MIA Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bbP＜0. 01

圖5　尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞Bax及Bcl-2表達的影響與正常組比較，aaP＜0. 05；與模型組比較，bbP＜0. 01Fig. 5 Effect of nicotine on the expression of Bax and Bcl-2 in rat chondrocytes induced by MIA Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bP＜0. 05，bbP＜0. 01

綜上所述，10－8，10－7，10－6mol/ L尼古丁具有保護軟骨細胞作用，可抑制MIA誘導的軟骨細胞凋亡并抑制Caspase 3活性，10－7，10－6mol/ L尼古丁可下調Bax表達，上調Bcl-2表達，并抑制PI3K表達及AKT磷酸化水平。

圖6　尼古丁對MIA誘導的軟骨細胞Caspase 3活性的影響與正常組比較，aaP＜0. 05；與模型組比較，bP＜0. 05，bbP＜0. 01Fig. 6 Effect of nicotine on the activity of Caspase 3 in rat chondrocytes induced by MIA Compared with normal control group，aaP＜0. 01；Compared with model group，bP＜0. 05，bbP＜0. 01

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〔修回日期〕2015－11－13

Inhibition of nicotine on apoptosis of chondrocytes induced by monosodium iodoacetate

HAN Gui-bin，ZHANG Shou，SUN Wei-wei，ZHONG Hai-tao，CHEN Jian-qiang，FAN Zhong-cheng

【Abstract】Objective To explore inhibition of nicotine on apoptosis of chondrocytes induced by monosodium iodoacetate（MIA）. Methods Rat primary chondrocytes were isolated by enzyme digestion，and the cells were treated with 10－8，10－7，10－6，10－5mol/ L nicotine for 48 h. The cases were randomly divided into five groups，except for normal group，the other four groups were treated with 4 μmol/ L MIA 24 h，and three groups were treated 10－8，10－7，10－6mol/ L nicotine. The viability of chondrocytes was detected by MTT assay. The apoptosis of chondrocytes was examed by Annexin V-FITC/ PI flow dual-staining method. The activity of cysteinyl aspartate specific proteinase 3（Caspase 3）was measured by spectrophotography method. The activation of phosphatidylinositol 3 kinase（PI3K）/ protein kinase B（AKT）and the expression of down-stream molecule Bax，Bcl-2 was assayed by western blot. Results 10－7，10－6mol/ L nicotine increased chondrocytes’viability（P＜0. 05），10－5mol/ L nicotine reduced chondrocytes’viability（P＜0. 05），and 10－8mol/ L nicotine didn‘t effect on chondrocytes’viability（P＞0. 05）. 10－8，10－7，10－6mol/ L nicotine could increaseMIA-induced chondrocytes’viability（P＜0. 05），suppress MIA-induced chondrocytes’apoptosis and the activity of MIA-induced Caspase 3（P＜0. 05）. Moreover，10－7，10－6mol/ L nicotine could increase the expression of PI3K and phosphorylation of AKT（P＜0. 05），down-regulate the expression of Bax and up-regulate the expression of Bcl-2 in MIA-induced rat chondrocytes（P＜0. 05）. Conclusion These results suggested nicotine could exert anti-apoptosis in MIA-induced rat chondrocytes，which might be related to PI3K/ AKT signal pathway.

【Key words】Nicotine；Ostearthritis；Chondrocytes；Apoptosis

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0040-00

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 009

［基金項目］海南省衛生廳基金資助項目（瓊衛－2013資助－036號）。

［作者簡介］韓貴賓（1974－），男，碩士，副主任醫師，研究方向：關節外科。E-mail：hanguibin456@163. com。

［通訊作者］張壽，Email：shouzhang456@163. com。