尾吊小鼠感染空間誘變大腸桿菌炎癥反應增強

姚 靜，程 江，裴雪楓，王靜宇，王俊鋒，張學林，劉長庭，袁 明（.石河子大學醫學院，新疆石河子 8000；.石河子大學第一附屬醫院檢驗科，新疆石河子 8000；.遼寧醫學院，遼寧錦州 00；.中國航天員科研訓練中心，航天醫學基礎與應用國家重點實驗室，北京 0009；.解放軍總醫院南樓呼吸科，北京 008）

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尾吊小鼠感染空間誘變大腸桿菌炎癥反應增強

姚 靜1，程 江2，裴雪楓3，王靜宇4，王俊鋒5，張學林5，劉長庭5，袁 明4
（1.石河子大學醫學院，新疆石河子 832000；2.石河子大學第一附屬醫院檢驗科，新疆石河子 832000；3.遼寧醫學院，遼寧錦州 121001；4.中國航天員科研訓練中心，航天醫學基礎與應用國家重點實驗室，北京 100094；5.解放軍總醫院南樓呼吸科，北京 100853）

【摘要】目的 觀察空間誘變大腸桿菌感染尾吊模擬失重小鼠后炎癥反應變化。方法 將40只C57BL/6小鼠隨機分為對照、對照染菌、尾吊及尾吊染菌組，采用ELISA和RT-qPCR方法分別檢測小鼠血漿和腸道組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的含量及mRNA表達，HE染色觀察小腸組織形態學的改變。結果 血漿炎癥因子ELISA及腸道組織炎癥因子PCR結果顯示，與對照組相比，實驗組小鼠血漿及腸道組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達均升高，且尾吊染菌組最為顯著（P＜0. 01或P＜0. 001）；小腸組織HE染色結果顯示，實驗組小腸粘膜均出現不同程度的損傷，且尾吊染菌組最為嚴重。結論 空間誘變大腸桿菌感染尾吊小鼠后可顯著升高血漿及腸道組織中炎癥因子表達，導致更嚴重的腸道黏膜屏障受損，提示尾吊模擬失重后感染空間誘變大腸桿菌可致機體的炎癥反應增強。

【關鍵詞】空間誘變大腸桿菌；模擬失重；炎癥因子；腸道組織

隨著我國載人航天事業的發展，尤其是后續載人空間站任務的實施，需要航天員在太空環境停留的時間越來越長。因此，對影響航天員健康的危險因素評估及防護措施研究就顯得非常重要。航天員在飛行過程中可受到失重、輻射、超重、振動、噪聲、心理緊張等多種不利因素的影響。這些因素會對機體造成損害，如出現空間運動病、肌肉萎縮、骨質脫鈣、心血管功能失調等［1－2］。也有研究顯示，航天飛行可造成機體多項免疫學參數的改變，導致機體免疫功能降低，使得機體受感染的機會大大增加［3］。同時在空間環境中，微生物出現毒力及耐藥性的改變，除了腐蝕航天設備，也對航天員的健康產生巨大威脅［4］。因此，研究失重/模擬失重下空間誘變菌感染所致炎癥反應的機制，對于其有效防控具有重要意義。本研究采用前期篩選出的空間誘變大腸桿菌T1－13菌株，通過模擬失重小鼠感染模型，探討空間誘變菌感染模擬失重小鼠對炎癥反應的影響。

1　材料和方法

1.1材料

1.1.1實驗動物40只SPF級C57BL/6雄性小鼠，體重18～22 g，周齡6～8周，購自北京維通利華實驗動物技術有限公司【SCXK（京）2012－0001】，實驗在中國航天員科研訓練中心實驗動物中心【SYXK（軍）2012－0020】開展，給予自由進食、飲水、23±2℃環境溫度、每晝夜保持12 h光照與12 h黑暗交替循環條件下飼養。

1.1.2空間誘變大腸桿菌菌株空間誘變型大腸桿菌T1－13由解放軍總醫院南樓呼吸科提供，該菌株搭載神舟十號飛船在軌飛行15 d，返回后測序分析發現存在耐藥及毒力基因突變。

1.1.3實驗試劑和藥物炎癥因子ELISA檢測試劑盒，購自上海藍基生物科技有限公司；TRIzol試劑購自invitrogen；反轉錄試劑盒、SYBR?Green熒光定量試劑盒購自大連寶生物公司。

1.1.4儀器和設備伯樂Model680酶標儀；電恒溫培養箱；離心機；eppendorf realplex PCR擴增儀；EDTA抗凝真空采血管，一次性注射器，灌胃針等。

1.2方法

1.2.1動物模型的建立及分組將40只C57BL/6小鼠隨機分為對照（Con）、對照染菌（Con + T1－ 13）、尾吊（TS）及尾吊染菌組（TS + T1－13），每組10只。參照陳杰等［5］改良的方法對小鼠進行頭低位30°尾部懸吊30 d后，將T1－13菌株配置成1. 2 ×108CFU/ mL溶度菌液，以灌胃法［6］對小鼠進行接種，0. 2 mL/鼠。72 h后1%戊巴比妥鈉腹腔注射麻醉小鼠，進行后續試驗。

1.2.2ELISA方法檢測血漿炎癥因子試驗當天以1%戊巴比妥鈉0. 2 mL/鼠腹腔注射麻醉小鼠，消毒后于心臟搏動最強處迅速進針行心臟采血，離心分離血漿，按ELISA試劑盒操作說明書分別檢測血漿中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6含量。

1.2.3腸道組織形態學觀察心臟采血完畢后頸椎脫位處死小鼠，消毒后暴露腹腔，無菌剪取小腸約2 cm，清除腸內容物后置于4%多聚甲醛中固定48 h，常規石蠟包埋、切片、HE染色、封片，光學顯微鏡觀察并拍照。

1.2.4腸道組織炎癥因子mRNA表達水平檢測TRIzol法提取小腸組織總RNA，按反轉錄試劑盒反轉錄為cDNA后，以其為模版進行real-time PCR分別檢測小腸組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6 mRNA的表達，引物序列見表1。設置反應程序：95℃預變性30 s；95℃變性5 s，60℃退火30 s，72℃延伸20 s，40個循環；95℃15 s、60℃15 s、95℃15 s進行溶解曲線分析。

1.2.5統計學處理采用GraphPad Prism5. 0分析軟件對實驗數據進行統計分析，組間比較采用ANOVA，兩兩比較采用Newman-Keuls檢驗方法，P ＜0. 05為差異有統計學意義。

表1　實時熒光定量PCR擴增引物Tab. 1 Primer pairs for the real-time PCR

圖1　血漿中炎癥因子的含量Note.*P＜0. 05，**P＜0. 01，***P＜0. 001 vs Con；#P＜0. 05，##P＜0. 01，###P＜0. 001 vs TS；n =10.Fig. 1 Inflammatory cytokines production in plasma

2　結果

2.1血漿中炎癥因子的含量

與對照組相比，Con + T1－13組血漿中TNF-α （P＜0. 05）、IL-1β（P＜0. 001）、IL-6（P＜0. 001）含量均明顯升高；TS組血漿中IL-1β（P＜0. 05）和IL-6（P＜0. 001）含量明顯升高，TNF-α升高但無明顯差異；TS + T1－13組血漿中TNF-α（P＜0. 01）、IL-1β（P＜0. 001）、IL-6（P＜0. 001）含量均明顯升高，且升高最為顯著。與TS組相比，TS + T1-13組血漿中IL-1β（P＜0. 001）和IL-6（P＜0. 05）含量明顯升高，TNF-α升高但無明顯差異（圖1）。

2.2腸道組織形態學觀察

組織形態學觀察結果可見，對照組小腸結構沒有明顯變化，從黏膜層到漿膜層結構完整，絨毛上皮細胞排列整齊（圖2A）。與對照組相比，Con + T1 －13組小腸絨毛頂端壞死脫落，有的地方整個絨毛壞死溶解，絨毛腫脹，固有層內可見炎性細胞浸潤，絨毛長度變小，腸腔內可見少量脫落的細胞碎片（圖2B）；TS組小腸絨毛上皮輕微增生（圖2C）；與Con + T1－13組相比，TS + T1－13組小腸絨毛出現類似病變，而且腸絨毛壞死情況較為嚴重，有的地方出現凝固性壞死，有的地方出現溶解性壞死，僅殘存部分結構，腸腔內出現大量壞死脫落的細胞碎片（圖2D）。

2.3腸道組織炎癥因子mRNA水平的表達

與對照組相比，Con + T1－13組小腸組織中TNF-α（P＜0. 05）、IL-1β（P＜0. 01）、IL-6（P＜0. 05）表達均明顯升高；TS組小腸組織中IL-6（P＜0. 05）表達明顯升高，TNF-α和IL-1β升高而無明顯差異；TS + T1-13組小腸組織中TNF-α（P＜0. 001）、IL-1β（P＜0. 01）、IL-6（P＜0. 001）表達均明顯升高，且升高最為顯著。與TS組相比，TS + T1 －13組小腸組織中TNF-α（P＜0. 01）、IL-1β（P＜0. 01）表達明顯升高，IL-6升高而無明顯差異（圖3）。

圖2　小腸組織病理改變（HE染色，×20）Note. A：Con；B：Con + T1－13；C：TS；D：TS + T1－13.（↑Necrosis in the top of intestinal villi；★Necrolysis of intestinal villi；☆cell debris from necrosis；▲Slight hyperplasia of chorioepithelium；?Coagulative necrosis）.Fig. 2 Histopathological changes in small intestine tissue（HE staining，×20）

圖3　腸道組織炎癥因子mRNA水平的表達Note.*P＜0. 05，**P＜0. 01，***P＜0. 001 vs Con；#P＜0. 05，##P＜0. 01，###P＜0. 001 vs TS；n =10.Fig. 3 mRNA expression level of inflammatory cytokines in intestinal tissue

3　討論

人類在進行太空探索、執行空間任務過程中，常會受到失重、超重、輻射、震動、噪聲等多種不利因素的影響。大量航天醫學研究結果表明，失重可造成航天員的免疫功能下降，且隨時間的延長而程度加重，從而導致機會性感染的機率增加，成為嚴重的健康風險及影響空間任務的主要障礙［7］。同時，在載人航天活動中，一些正常定植的細菌會隨著航天員或航空部件進入太空，并在太空艙內形成微生物群區。在特殊的空間環境下，微生物基因表達發生變化，毒力增加，生長速度加快，耐藥性增強，使得機體受感染機會大大增加［4，8－9］。大腸桿菌是哺乳動物常見的腸道正常寄生菌群，當機體免疫力低下、腸道正常菌群紊亂時可機會性致病，引起機體相應的腸道疾病。Raja Vukanti等［10］研究發現，在模擬失重條件下，大腸桿菌活力和生長速度明顯加快，細菌代謝產物明顯增多。

在一項模擬失重對小鼠T細胞亞群和某些細胞因子的影響的研究中發現［11］，尾部懸吊7 d后，小鼠CD8+、CD4+T細胞數量明顯降低，且IL-6活性呈增強趨勢，另外一項長期飛行對機體免疫力影響的研究中發現［12］，不同時間的空間飛行后，血漿炎癥因子TNF-α、IL-1β均有不同程度的升高。我們參考既往已成功建立的多種地面模擬失重模型［13］，通過前期實驗篩選出空間誘變型大腸桿菌T1-13，感染模擬失重小鼠，建立模擬失重小鼠腸道感染模型，在尾吊30 d后染菌3 d觀察血漿及腸道組織中炎癥因子TNF-α、IL-1β、IL-6的表達，發現三種炎癥因子在實驗組中均升高，且TS + T1-13組最為顯著，說明模擬失重及空間致病菌確可使機體免疫力下降、炎癥反應增強，且三種炎癥因子在全身感染性疾病和腸道黏膜免疫中均發揮重要作用。TNF-α是由單核巨噬細胞產生的具有多種功能的細胞因子，在炎癥的級聯反應中首先被激活，并誘導IL-1β、IL-6、IL-8等的產生。當細菌感染時，TNF-α水平迅速升高，但其高峰期時間較IL-6短，并很快下降至正常水平［14］。在一項長期飛行的研究中發現，血漿中TNF-α在飛行中升高，飛行后較飛行前無明顯改變［12］。我們實驗顯示，TS組TNF-α表達較對照組雖有升高，但不明顯，認為與上述所述TNF-α表達峰值時間有關。另外，有研究表明暴露于不同時間的空間飛行，機體產生的免疫應答效應不盡相同，且免疫功能的恢復與飛行后返回地面的時間可能相關［3，12］。

關于失重對機體消化系統的影響，有研究人員利用尾部懸吊大鼠模型，觀察模擬失重14 d和21 d小腸組織結構，光鏡和電鏡結果均顯示小腸黏膜絨毛和微絨毛稀少，變短變寬，表面積減少，小腸粘膜緊密連接蛋白表達減少，黏膜通透性增加，推測小腸粘膜微觀結構的改變可能是航天員在航天飛行中出現消化系統不良癥狀的重要原因之一［15］。我們在實驗過程中觀察小鼠狀態，發現實驗組小鼠均出現不同程度的厭食、消瘦、精神萎靡，進一步觀察小腸組織結構，證實了模擬失重會改變腸道黏膜屏障的觀點［16］。另外在失重不良刺激作用下，胃腸道應激反應、蠕動紊亂、血管床淤血、微生態失調等一系列因素造成腸黏膜受損，細菌及其代謝產物由門靜脈入血，導致機體出現全身炎癥反應。

綜上所述，空間誘變菌及模擬失重可使小鼠血漿及腸道組織中炎癥因子表達升高、腸道黏膜屏障受損，提示空間環境較地面更易使機體炎癥反應增強。

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〔修回日期〕2016－01－25

Increased inflammatory reaction in tail-suspension mice infected by E. coli in spaceglight

YAO Jing1，CHENG Jiang2，PEI Xue-feng3，WANG Jing-yu4，WANG Jun-feng5，ZHANG Xue-lin5，LIU Chang-ting5，YUAN Ming4
（1. The Medical College of Shihezi University，Xinjiang Shihezi 832000，China；2. Department of Clinical Laboratory，The First Affiliated Hospital of Shihezi Medical University，Xinjiang Shihezi 832000，China；3. Liaoning Medical College，Liaoning Jinzhou 121001，China；4. The Key Laboratory of Space Medicine Fundamentals and Application，China Astronaut Research and Training Center，Beijing 100094，China；5. Nanlou Respiratory Diseases Department，Chinese PLA General Hospital，Beijing 100853，China）

【Abstract】Objective To observe the changes of inflammatory reaction in tail-suspension mice after infected by E. coli in spaceflight. Methods 40 C57BL/6 mice were randomly divided into four groups：control group（Con），control + E. coli T1-13 group（Con + T1-13），tail suspension group（TS），tail suspension + E. coli T1-13 group（TS + T1-13）. The inflammatory cytokines TNF-α，IL-1β and IL-6 production in plasma and mRNA level in intestinal tissue were detected by ELISA and RT-qPCR，and HE staining was used to represent the morphology changes in small intestine tissue. Results Compared with the control group，the expression of inflammatory cytokines in plasma and intestinal tissue of allexperimental groups were increased，and the TS + T1-13 group was most significant（P＜0. 01 or P＜0. 001）. HE staining showed that the small intestine mucosa in the experimental groups were damaged in different degrees，and the damage of TS + T1-13 group was most serious. Conclusions The E. coli from spaceflight increased significantly the expression of inflammatory cytokines in plasma and intestinal tissue from infected tail-suspension mice，and brought more serious damages to the small intestinal mucosal barrier，which suggested that the inflammatory reaction would be increased in tailsuspension mice infected by E. coli from spaceflight.

【Key words】Space mutation E. coli；Simulated microgravity；Inflammatory cytokines；Intestinal tissue

【中圖分類號】R-332

【文獻標識碼】A

【文章編號】1671-7856（2016）03-0001-05

doi：10. 3969. j. issn. 1671－7856. 2016. 03. 001

［基金項目］國家重點基礎研究發展計劃（973計劃）（2014CB744404）。

［作者簡介］姚靜（1988－），女，碩士，研究方向：臨床分子生物學診斷，E-mail：yaojing_hnzz@163. com。

［通訊作者］袁明（1977－），男，副研究員，博士，研究方向：空間生物學，E-mail：yuanming7711@ aliyun. com；程江（1963－），男，教授，碩士，研究方向：實驗室管理及分子生物學，E-mail：chengjiang1980@ sina. com。