牛磺酸對妊娠期小鼠子宮平滑肌收縮的抑制作用*

葛萬文,李菊香,袁國強,王東萍

(1.蘭州大學第二醫院婦產科，甘肅蘭州 730030；2.蘭州大學第二醫院神經病學研究所，甘肅蘭州 730030；3.甘肅省人民醫院血液科，甘肅蘭州 730000)

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牛磺酸對妊娠期小鼠子宮平滑肌收縮的抑制作用*

葛萬文1,李菊香1,袁國強2△,王東萍3

(1.蘭州大學第二醫院婦產科，甘肅蘭州 730030；2.蘭州大學第二醫院神經病學研究所，甘肅蘭州 730030；3.甘肅省人民醫院血液科，甘肅蘭州 730000)

[摘要]目的探討牛磺酸對縮宮素預收縮的妊娠小鼠離體子宮平滑肌收縮作用的影響。方法建立小鼠離體子宮平滑肌收縮模型，觀察累積加入不同水平的牛磺酸對縮宮素誘導的小鼠離體子宮平滑肌收縮的影響。高效液相色譜法檢測妊娠期、足月臨產小鼠子宮平滑肌中牛磺酸水平變化。結果牛磺酸(5×10-3～4×10-2mol/L)對縮宮素(0.005 U/L)誘導的妊娠期小鼠離體子宮平滑肌的收縮有濃度依賴性的抑制作用，其平均最大抑制效應(Emax)值為(40.72±3.69)%；牛磺酸選擇性轉運抑制劑β-丙氨酸(7×10-2mol/L)競爭性拮抗牛磺酸對妊娠期小鼠子宮平滑肌收縮的抑制作用。牛磺酸(5×10-3～4×10-2mol/L)對未孕小鼠離體子宮平滑肌的收縮也具有濃度依賴性的抑制作用，其抑制作用弱于妊娠組，Emax值為(26.63±3.58)%。妊娠期小鼠子宮平滑肌中牛磺酸水平自中孕期開始顯著降低，晚孕期后則逐漸回升。結論牛磺酸可能通過抑制電壓依賴性鈣通道介導的胞外Ca2+內流對孕鼠離體子宮平滑肌的收縮有濃度依賴性抑制作用。

[關鍵詞]牛磺酸；子宮；肌細胞，平滑肌；抑制作用；轉運

牛磺酸(Taurine)是動物體內一種含硫β-氨基酸，它以游離氨基酸形式廣泛分布于腦、視網膜、心臟、骨骼肌及子宮等組織和器官中[1]。牛磺酸對多器官和系統有著相當重要的作用，主要參與調節神經、視覺、心血管、內分泌、免疫及生殖等系統，對維持細胞內Ca2+穩態、調節細胞滲透壓平衡及清除氧自由基等發揮著重要作用[2-4]。已有研究證實牛磺酸對小腸、氣管平滑肌具有舒張作用[5]，以此為切入點，本實驗旨在研究其對縮宮素誘導的妊娠期小鼠離體子宮平滑肌收縮作用的影響，為牛磺酸作為新型保胎藥提供實驗依據。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1實驗動物SPF級C57BL/6小鼠100只，由蘭州大學醫學院實驗動物中心提供。雄鼠30只，雌鼠70只，體質量25～30 g，日齡60～80 d。適應性飼養7 d，按雌(60只):雄(30只)為2∶1的比例合籠交配，每晨作陰道涂片，以發現精子當天定為妊娠第0天。早孕期為孕7 d，中孕期為孕12 d，晚孕期為孕18 d，將晚孕期雌鼠用于子宮平滑肌肌張力測定。健康未孕雌鼠(10只)作為對照組。

1.1.2藥品和試劑牛磺酸(批號TB0926)、β-丙氨酸(批號A6168)，純度大于或等于98%，均購于生工生物工程(上海)股份有限公司；縮宮素注射液(5 U/mL，批號H34022980)，購于安徽宏業藥業有限公司；常規試劑，國產分析純。

1.1.3實驗儀器BL-420F生物信號采集與分析系統(成都泰盟科技有限公司)；HS-4B精密恒溫浴槽(成都儀器廠)；JZ100肌肉張力換能器(高碑店市新航機電設備有限公司)；Waters1525高效液相色譜儀(美國Waters公司)。

1.2方法

1.2.1離體子宮平滑肌的制備取C57BL/6雌性妊娠小鼠，頸椎脫臼處死，暴露腹腔，迅速剪取子宮，沿血供側小心縱向剖開全層子宮平滑肌，去除胎鼠及胎盤，用PBS緩沖液清洗干凈。在體視解剖鏡下，將子宮內膜與平滑肌分離，制成一段約3 mm×10 mm子宮平滑肌肌條，得到的肌條一份立即放入盛有經混合氣(95%O2+5%CO2)飽和的37.50 ℃ De-Jalon液(NaCl 9.40 g、KCl 0.42 g 、NaHCO30.50 g、CaCl20.06 g、葡萄糖 0.50 g，蒸餾水稀釋至1 000 mL)的培養皿中，另一份生理鹽水清洗后立即于液氮冷凍，之后-80 ℃儲存備用。

1.2.2離體子宮平滑肌收縮模型的制備將子宮平滑肌肌條用絲線結扎兩端，下端系于L型通氣鉤上固定，置于盛有20 mL De-Jalon液的恒溫浴槽中，上端連接張力換能器。恒溫浴槽內的溫度保持在(37.00±0.50)℃，并向其中勻速通入混合氣體。換能器與BL-420F生物信號采集與分析系統相連，肌條負荷1 g，平衡30 min，待系統穩定后，向浴槽內加入0.005 U/L的縮宮素，待肌條收縮平穩，即出現規律收縮波形時，視為離體子宮平滑肌收縮模型建立成功。

1.2.3子宮平滑肌肌張力記錄離體子宮平滑肌收縮模型建立成功后，第1組以累加的方式加入牛磺酸，使浴槽內藥物終濃度分別為5×10-3、1×10-2、2×10-2、4×10-2mol/L，加藥間隔15 min，記錄子宮平滑肌收縮情況。第2組提前15 min添加牛磺酸轉運抑制劑β-丙氨酸(7×10-2mol/L)，之后添加牛磺酸(4×10-2mol/L)，記錄有拮抗劑存在時子宮平滑肌收縮情況。對照組累積加入相同濃度的生理鹽水，記錄子宮平滑肌收縮情況。

1.2.4妊娠期、產后和健康未孕小鼠子宮平滑肌中牛磺酸水平的測定通過離體子宮制備法獲得早孕、中孕、晚孕、產后和健康未孕小鼠的子宮平滑肌，采用柱前衍生法，以鄰苯二甲醛為衍生劑，β-巰基乙醇為保護劑，應用高效液相色譜法(HPLC)測定子宮平滑肌中牛磺酸水平。

1.2.5計算平均最大抑制效應(Emax)值以給藥前15 min縮宮素(0.005 U/L)誘導的子宮平滑肌平均收縮幅度作為基礎值，給予每一個藥物濃度后，子宮平滑肌平均收縮幅度作為效應值。子宮平滑肌收縮抑制率(%)=(基礎值-效應值)/基礎值×100%，計算出Emax值。

2結果

2.1牛磺酸對妊娠期小鼠離體子宮平滑肌收縮的影響牛磺酸(5×10-3、1×10-2、2×10-2、4×10-2mol/L)能濃度依賴性地抑制縮宮素(0.005 U/L)誘導的妊娠小鼠子宮平滑肌的持續收縮(表1)，在濃度為4×10-2mol/L時其抑制效應達到最大，Emax為(40.72±3.69)%。牛磺酸(4×10-2mol/L)對妊娠小鼠子宮平滑肌收縮的這種抑制作用能夠被牛磺酸轉運抑制劑β-丙氨酸(7×10-2mol/L)拮抗，Emax為(9.94±0.46)%。

2.2牛磺酸對未孕小鼠離體子宮平滑肌收縮的影響 不同濃度牛磺酸(5×10-3、10-2、2×10-2、4×10-2mol/L)能劑量依賴性地抑制縮宮素(0.005 U/L)引起的未孕小鼠子宮平滑肌的持續性收縮(表2)，Emax為(26.63±3.58)% 。但牛磺酸對未孕小鼠的這種抑制作用要弱于對妊娠期小鼠子宮平滑肌的抑制，見圖1。

表1　不同濃度牛磺酸對妊娠期小鼠子宮平滑肌收縮的

a：P<0.05，b：P<0.01,與生理鹽水比較。

表2　不同濃度牛磺酸對未孕小鼠子宮平滑肌收縮的

a：P<0.05，b：P<0.01,與生理鹽水比較。

a：P<0.05，b：P<0.01,與未孕組比較。

圖1不同濃度牛磺酸對縮宮素誘導的妊娠期、未孕小鼠子宮平滑肌收縮的影響

2.3小鼠子宮平滑肌中牛磺酸水平測定未孕小鼠子宮平滑肌中牛磺酸為(8.94±0.37)μmol/L，而妊娠期小鼠子宮平滑肌中牛磺酸在早孕期變化并不明顯，自中孕期開始明顯降低(P<0.05)，晚孕期后出現緩慢回升，直至足月臨產(PP1)及產后(PP2)恢復到正常水平，見圖2。

*：P<0.05，與D1～D6比較。

圖2牛磺酸在小鼠不同妊娠階段子宮平滑肌中的水平

3討論

牛磺酸作為人體條件性必需氨基酸，是調節機體正常生理功能、維持機體自穩態的重要細胞保護物質，近年來其研究越來越受到人們的重視[6]。臨床上已將牛磺酸用于預防性治療心血管疾病、糖尿病等[7-9]。但是，至今國內外尚未見牛磺酸對子宮平滑肌作用的報道。

牛磺酸通過兩種途徑集聚于細胞內。(1)機體自身合成，但合成能力較弱，一般不能充分滿足機體自身需求；(2)通過細胞膜上牛磺酸轉運體將血漿牛磺酸跨膜轉運至細胞內，以保證機體所需。牛磺酸通過細胞內外轉運調節機體牛磺酸生物“穩態”，以發揮其生物學效應[10]。牛磺酸轉運體(taurine transporter,TAUT)存在于細胞膜上，不同種屬間具有同源性，是Na+、Cl-依賴性的Na+-K+-ATPase供能的轉運體。機體內存在多種類型的TAUT，且各型TAUT分布不同，使得各組織細胞的TAUT攝入牛磺酸的量不同，以調節機體細胞內外牛磺酸平衡，發揮其生物學作用。目前已克隆出多種TAUT亞型，如從大鼠腦cDNA庫中克隆出牛磺酸/β-丙氨酸轉運體，此轉運體可轉運牛磺酸和β-丙氨酸[11]。本實驗表明，牛磺酸對縮宮素誘導的妊娠和未孕小鼠子宮平滑肌的收縮均具有濃度依賴性的抑制作用，β-丙氨酸競爭性拮抗牛磺酸對妊娠小鼠子宮平滑肌收縮的抑制作用，且對妊娠小鼠子宮平滑肌收縮的抑制作用要強于對未孕小鼠子宮平滑肌的作用。在妊娠期內子宮基本處于靜息狀態，只有在足月臨產時才會出現高頻率、高強度的收縮，這種狀態的轉化與子宮平滑肌細胞收縮性和興奮性相關分子的表達有關。子宮平滑肌細胞興奮性的高低取決于細胞膜電位，細胞膜表達的鉀離子通道對膜電位的維持起著至關重要的作用，大電導鈣激活鉀通道(BKCa)則是妊娠子宮平滑肌細胞最主要的鉀離子通道[12-14]。縮宮素通過激活子宮平滑肌細胞膜上的電壓依賴性鈣通道(PDC)使Ca2+向肌細胞內流，前列腺素作為Ca2+載體與Ca2+形成復合體并將其帶入肌細胞內。胞內游離Ca2+作為肌肉興奮-收縮偶聯的活化劑，與肌動蛋白、肌漿蛋白結合引起子宮收縮[15]。牛磺酸作為機體內源性Ca2+穩態調節劑，維持著細胞內鈣穩態。牛磺酸通過激活BKCa通道，使BKCa活化，K+外流，膜超極化，使電壓依賴性鈣通道失活，胞內Ca2+水平下降，引起肌細胞舒張。β-丙氨酸作為TAUT抑制劑，可與牛磺酸競爭性的結合TAUT，引起細胞內牛磺酸耗竭。本實驗中，預先加入的β-丙氨酸與子宮平滑肌細胞膜上牛磺酸/β-丙氨酸轉運體相結合，競爭性抑制細胞對牛磺酸的攝取，造成牛磺酸轉運障礙，使得胞內牛磺酸水平下降，減弱牛磺酸對Ca2+的調節作用。

在不同的妊娠階段，機體內分泌環境發生顯著變化，子宮平滑肌中牛磺酸水平存在差異，早孕期胚胎剛剛形成，子宮平滑肌細胞內牛磺酸水平維持在較高水平，隨著妊娠時間的增加，中孕期以后牛磺酸水平顯著降低，之后則逐漸緩慢回升，表明在妊娠初期子宮平滑肌細胞通過其胞膜上的TAUT將牛磺酸由胞外轉運至胞內，胞內高水平的牛磺酸通過抑制平滑肌的收縮為胚胎生長發育提供穩定的內環境，隨著妊娠的繼續進行，胚胎發育逐漸成熟，牛磺酸又經TAUT轉運出胞外，牛磺酸水平降低，但仍處于相對穩定的水平，以保證胚胎的正常發育，預防早期流產的發生，直至足月臨產后恢復到正常水平。

綜上所述，本實驗結果提示，牛磺酸對妊娠期小鼠子宮平滑肌的收縮具有濃度依賴性的抑制作用，β-丙氨酸對牛磺酸舒張子宮平滑肌作用的拮抗效應提示牛磺酸的舒張作用與其跨細胞膜轉運有關，可能主要通過抑制電壓依賴性鈣通道介導的胞外Ca2+內流實現。牛磺酸幾乎無毒性作用，無抗原性，各種給藥方式均易吸收，有望成為早期妊娠時保胎的制劑，以減少孕期流產的發生。

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Inhibitory effects of taurine on contraction of pregnant mouse uterine smooth muscle*

GeWanwen1,LiJuxiang1,YuanGuoqiang2△,WangDongping3

(1.DepartmentofGynecologyandObstetrics;2.ResearchInstituteofNeurology,SecondHospitalofLanzhouUniversity,Lanzhou,Gansu730030,China;3.DepartmentofHematology,GansuProvincialPeople′sHospital,Lanzhou,Gansu730000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the influence of taurine on the contraction action of uterine smooth muscle in vitro in pregnant mouse.MethodsThe contraction model of in vitro mouse uterine smooth muscle was established.The influence of accumulated adding different levels of taurine on the oxytocin induced in vitro uterine smooth muscle contraction was observed.The change of taurine levels in isolated uterine smooth muscle was also evaluated by high-performance liquid chromatography(HPLC).ResultsTaurine (5×10-3-4×10-2mol/L) had the concentration- dependently inhibiting effect on oxytocin-induced uterine smooth muscle contractions in pregnant mouse.The average maximal inhibiting effect(Emax) value was (40.72±3.69)%.The taurine selective transport inhibitor beta-alanine(7×10-2mol/L) competitively antagonized the inhibiting effect of taurine on the contraction action of isolated uterine smooth muscle.Taurine (5×10-3-4×10-2mol/L) also concentration-dependently inhibited the contractions of isolated uterine smooth muscle from non-pregnant mouse with the Emax value of (26.63±3.58)%,but its inhibiting effect was weaker than that of pregnant mouse.The concentration of taurine in uterine smooth muscle was significantly decreased from middle pregnancy and was gradually increased after late pregnancy.ConclusionTaurine has the concentration-dependent inhibiting effect on the contraction of pregnant mouse isolated uterine smooth muscle possibly via the blockage of extracellular Ca2+influx mediated by potential-dependent calcium channel.

[Key words]taurine;uterus;myocytes,smooth muscle;inhibition;transport

doi:·論著·10.3969/j.issn.1671-8348.2016.04.001

*基金項目：國家自然科學基金資助項目(81341100)；甘肅省自然科學基金資助項目(130RJYA033)； 蘭州大學中央高校基本科研業務費專項資金資助(861642)。

作者簡介：葛萬文(1984-)，實習研究員，碩士研究生，主要從事藥物對平滑肌運動的研究。△通訊作者，Tel：13893292173；E-mail：yuangq06@163.com。

[中圖分類號]R337.2

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)04-0433-03

(收稿日期：2015-08-11修回日期：2015-10-12)