基于MALDI-TOF-MS質譜技術對蜂蜜中芽孢桿菌的鑒定與分型

宗 凱， 周莉質， 李云飛， 陳雪嬌， 孫娟娟， 鄭海松， 余曉峰

(安徽出入境檢驗檢疫局，安徽合肥 230022)

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基于MALDI-TOF-MS質譜技術對蜂蜜中芽孢桿菌的鑒定與分型

宗 凱， 周莉質， 李云飛， 陳雪嬌， 孫娟娟， 鄭海松， 余曉峰*

(安徽出入境檢驗檢疫局，安徽合肥 230022)

摘要[目的]對分離自不同產地和品種的蜂蜜中的芽孢桿菌屬進行鑒定分型，探索利用蜂蜜中芽孢桿菌特征指紋圖譜對蜂蜜產地和品種進行溯源的可行性。[方法] 從44種不同產地和品種蜂蜜中分離出44株芽孢桿菌，3株銅綠假單胞菌。采用基質輔助激光解析-電離飛行時間質譜(MALDI-TOF-MS)條件對分離的芽孢桿菌進行鑒定分型和聚類分析。[結果] 44株芽孢桿菌中鑒定出蠟樣芽孢桿菌(B.cereus )31株，短小芽孢桿菌(B.pumilus)5株，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)3株，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)2株，炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)1株，土壤短芽孢桿菌(Brevibacillus agri.)2株。通過多次重復試驗，表明從同一份樣品或同一品牌蜂蜜樣品中能穩定分離到芽孢桿菌，獲得的蛋白指紋圖譜具有極好的穩定性。[結論]MALDI-TOF-MS可根據獲得的芽孢桿菌蛋白指紋圖譜將芽孢桿菌劃分為不同類型，可作為一種新的根據蜂蜜中芽孢桿菌的特征指紋圖譜進行溯源的方法。

關鍵詞基質輔助激光解析-電腦飛行時間質譜;芽孢桿菌;鑒定分析

蜂蜜的成分復雜，營養豐富，是人類傳統的天然營養保健品。我國是蜂蜜生產、銷售和出口大國，隨著蜂產品市場日益繁榮，蜂產品的質量安全問題逐漸突顯。蜂蜜產品的溯源檢測技術在蜂蜜溯源體系中起到了極為重要的技術支持作用。目前，溯源分析中涉及的檢測技術主要有色譜、質譜、光譜和分子生物學等。其中，質譜檢測技術作為溯源檢測技術的重要組成部分，在溯源分析中發揮了極為重要的作用。目前采用質譜技術對蜂產品進行溯源主要是對蜂蜜中有機成分、 揮發性物質、 特征化合物和同位素比率等進行分析檢測，從而對不同種類的蜂蜜進行溯源分析。筆者主要研究了多個產地和品種的蜂蜜中芽孢桿菌的特征蛋白質指紋峰，建立蜂蜜中芽孢桿菌蛋白質指紋圖譜庫對蜂蜜產品進行溯源，開拓了蜂蜜溯源技術的新思路。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1蜂蜜樣品。供試樣品為不同產地不同品種的蜂蜜，均由安徽省阜陽市百和食品有限公司提供。樣品采集后置于4 ℃冰箱保存。

1.1.2培養基。營養肉湯培養基。

1.1.3MALDI-TOF-MS基質和溶液系統。基質：α-氰基-4-羥基肉桂酸(α-cyan o-4-hydroxycinnamic acid，CHCA)， 島津公司。溶劑：檢測樣品配制基質的溶劑為乙腈∶乙醇∶ 水 (1∶1∶1) 。以大腸桿菌ATCC8739作為標準菌株，用來校準儀器。MALDI-TOF-MS基質溶液是用溶劑將基質配成飽和溶液，基質溶液現用現配。

1.1.4儀器與設備。基質輔助激光解析電離飛行時間質譜儀，日本島津公司confidence，儀器參數為：線性操作模式，正離子，基質抑制偏轉模式，脈沖離子提取時間350 ns，質量范圍1 500～15 000 D，激光點擊數為20。每次試驗前都要處理好的大腸桿菌ATCC8739的標準峰圖在采集數據的質量范圍內(1 500～15 000 D) 進行質量校正，校正完畢后方可進行質譜圖數據的采集。

1.2方法

1.2.1從蜂蜜中分離芽孢桿菌。稱取1 g蜂蜜，加入配制好的營養肉湯中，37 ℃培養24～48 h，然后劃線于血平板上，將劃線后血平板37 ℃培養24 h，挑單菌落再劃線于新的血平板上培養24 h。

1.2.2MALDI-TOF-MS質譜上樣前處理。無菌操作挑取100 mg左右血平板上菌落于1.5 mL EP管中(1.5 mL EP管預先加入0.5 mL生理鹽水)，振蕩1 min后離心，將底部菌落用300 μl 蒸餾水轉于EP管中， 加900 μL無水乙醇，振蕩2 min后12 000 r/min離心2 min，棄去上清液，室溫放置10 min,沉淀中加30 μL 70%甲酸，振蕩混勻，超聲15 min,加30 μL乙腈，振蕩混勻， 8 000 r/min再次離心1 min后迅速將上清液轉入新的EP管中。取0.5 μL置于MALDI-TOF-MS樣品靶盤上，室溫晾干后迅速用0.5 μL基質溶液覆蓋，在空氣中晾干。作為校準用的大腸桿菌ATCC8739培養及前處理過程與蜂蜜樣品中芽孢桿菌分離培養及前處理相同。每個樣品各點3個平行孔。

2結果與分析

2.1MALDI-TOF-MS對蜂蜜中分離菌株的鑒定 比對44個不同產地和品種蜂蜜中分離的44株芽孢桿菌和3株銅綠假單胞菌。44株芽孢桿菌中鑒定出蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)31株，短小芽孢桿菌(B.pumilus)5株，枯草芽孢桿菌(B.subtilis)3株，地衣芽孢桿菌(B.licheniformis)2株，炭疽芽孢桿菌(B.anthracis)1株，土壤短芽孢桿菌(Brevibacillusagri.)2株。鑒定的代表性圖譜，具體統計數據見表1。

表1　蜂蜜樣品產地和品種信息

由表1可以看出，分離自44個不同產地和品種的蜂蜜的44張芽孢桿菌質量圖譜，既存在相似的離子峰，也大多數有各自的特征離子峰，且通過多次重復取樣試驗，這種差異特征離子峰檢測重復性和穩定都非常好，因此可以把這些特征峰代表的特征指紋圖譜作為某一產地和品種品牌蜂蜜的參考標記峰，作為蜂蜜產地、品種甚至品牌的溯源根據。

圖2　蠟樣芽孢桿菌 31 株菌的聚類分析Fig.2　Cluster analysis of 31 strains of Bacillus cereus

2.2MALDI-TOF-MS對芽孢桿菌的分型將所得31株蠟樣芽孢桿菌的蛋白指紋圖譜導入微生物鑒定數據庫，通過軟件自帶TAXMONY功能將蠟樣芽孢桿菌31株菌的蛋白質指紋圖譜進行聚類分析(圖2),按照65%相似性作為判定水平，170001_2G3、220002_2A4、1600001_2C1、240001_2A1、210001_2G1菌株肽指紋圖譜較為相近，140001_2F1、470002_2C4、250001_2H1、46-20001_2E3、330002_2E4、161-20001_2E3、190001_2H3、430002_2E2菌株肽指紋圖譜較為相近。

3討論

蜂蜜主要成分為糖類物質，其中主要是葡萄糖和果糖，在高糖的環境下僅有部分微生物能存活，其中芽孢桿菌因為其耐受的芽孢體的存在而廣泛存在于蜂蜜中。通過試驗，從44種蜂蜜中(包括40種原蜜和4種商品蜜)均分離到了芽孢桿菌，其中主要為蠟樣芽孢桿菌，其次為枯草芽孢桿菌，還有些是短小芽孢桿菌等。通過對這些芽孢桿菌多次劃板分離得到其純培養物，采用簡單前處理獲得較高的鑒定率。從表1 中可以看到，從各類蜂蜜中分離出來的芽孢桿菌的鑒定率基本上在80%以上，為可信結果(>75%)。每株從各類蜂蜜中分離出來的芽孢桿菌圖譜除存在共有峰外，還存在各自的特征峰，且穩定性和重復性好。

基于單菌落的 MALDI-TOF-MS 技術用于芽孢桿菌鑒定,與目前的細菌鑒定方法[1-2]相比，其原理和操作均存在差異，無需復雜的前處理，只需獲得某細菌純培養物，進行簡單前處理甚至不需要進行任何的前處理，只需將極少量的純培養物涂抹于靶板表面，再覆蓋少量基質,即可上機鑒定，獲得穩定的細菌肽指紋圖譜，圖譜數據自動分析、檢索與比對,實現了一種高通量和高效率的鑒定方法。在應用MALDI-TOF-MS分析全細菌時,獲取的全細菌指紋圖譜還具有很好的重現性和穩定性[3-4]。

島津公司MALDI-TOF-MS confidence型號質譜所帶的微生物數據庫中，蠟樣芽孢桿菌普通圖譜僅有19份，超級圖譜僅有5份，枯草芽孢桿菌普通圖譜僅有20份，超級圖譜僅有6份。該研究從蜂蜜中分離的各類芽孢桿菌十分豐富，通過鑒定后均可將其肽指紋圖譜加入微生物數據庫中，以豐富數據庫中芽孢桿菌的標準圖譜數量。

參考文獻

[1] 趙貴明，楊海榮，趙勇勝，等.MALDI-TOF 質譜技術對克羅諾桿菌的鑒定與分型[J].微生物學通報，2010, 37(8): 1169-1175.

[2] 呂 佳，盧行安,劉淑艷，等.MALDI-TOF-MS技術鑒定食源性致病菌的影響因素[J].分析儀器，2011(2)：12-17.

[3] 謝田剛,王運鐸,鄭秋月,等.銅綠假單胞菌的 MALDI-TOF-MS 檢測方法的建立[J].中國微生態學雜志，2012，24(10):938-940.

[4] 王曄茹， 崔生輝， 李鳳琴．基質輔助激光解吸電離飛行時間質譜在沙門菌檢測和鑒定分型中的應用研究[J].衛生研究，2008，37(6)：685-689．

Identification and Analysis ofBacillusin Honey Based on MALDI-TOF-MS

ZONG Kai, ZHOU Li-zhi, LI Yun-fei,YU Xiao-feng*et al

(Anhui Entry-exit Inspection and Quarantine Bureau, Hefei, Anhui 230022)

Abstract[Objective] The species of the genus Bacillus isolated from different habitats and species honey were identified. The feasibility of using Bacillus characteristic fingerprint in honey to trace the origin and species of honey was explored. [Method] Forty-four strains of Bacillus and three strains of Pseudomonas aeruginosa were isolated from forty-four different varieties of honey. Using matrix-assisted laser desorption/ionization time of flight mass spectrometry (MALDI-TOF-MS), cluster analysis and typing of Bacillus isolated from honey was conducted. [Result] Thirty-one strains of Bacillus cereus, five strains of Bacillus pumilus, three strains of Bacillus subtilis, two strains of Bacillus licheniformis, one strain of Bacillus anthracis, and two strains of Brevibacillus agri. were identified from forty-four strains of Bacillus. The result from repeated experiments indicated that stabilized Bacillus could be isolated from the same one or brand of honey so that obtained proteome profiles were more stabilized. [Conclusion] MALDI-TOF-MS can divide Bacillus into different types on the basis of the proteome profiles of obtained Bacillus and as a new method to trace the origin of honey based on the characteristic fingerprint of honey.

Key wordsMALDI-TOF-MS; Bacillus; Identification and analysis

作者簡介宗凱(1985- )，男，安徽安慶人，工程師，碩士，從事植物檢疫研究。

收稿日期2016-01-29

中圖分類號S 896.1

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)08-107-03