雙醋瑞因對碘乙酸鈉誘導的骨關節炎軟骨細胞損傷的保護作用

張慧東

(河北省唐山市工人醫院骨二科　063000)

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雙醋瑞因對碘乙酸鈉誘導的骨關節炎軟骨細胞損傷的保護作用

張慧東

(河北省唐山市工人醫院骨二科063000)

[摘要]目的探討雙醋瑞因對碘乙酸鈉(MIA)誘導的骨關節炎軟骨細胞的保護作用。方法實驗分為正常組，模型組(4 μM MIA)，雙醋瑞因低、中、高劑量組(1、10、100 μM)。噻唑藍(MTT)法檢測各組軟骨細胞活力；分光光度法檢測各組半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)活性；Western blot分析核因子-κB (NF-κB)信號通路激活情況及下游靶蛋白Bax、Bcl-2、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)的表達量。結果1、10、100 μM雙醋瑞因能提高MIA誘導的大鼠軟骨細胞的活力并降低Caspase-3活性(P<0.05)；10、100 μM雙醋瑞因能降低IκBα及NF-κB磷酸化水平，并下調Bax、MMP-9及MMP-13的表達，上調Bcl-2的表達(P<0.05)。結論雙醋瑞因能夠抑制MIA誘導的軟骨細胞凋亡與細胞外基質降解，與NF-κB信號通路有關。

[關鍵詞]骨關節炎；雙醋瑞因；軟骨細胞；凋亡；NF-κB信號通路

骨關節炎(osteoarthritis，OA)是一種多發于老年人的慢性退行性關節疾病，以關節軟骨退行性變和關節周圍骨質增生為主要病理特征，主要與年齡、性別、遺傳因素等有關，而軟骨病變是骨關節炎的中心環節[1-2]。現治療OA的藥物主要分為非特異性和特異性藥物，非特異性藥物只能緩解癥狀，無法改善病情，如非甾體抗炎藥物等；而特異性藥物不僅能抗炎鎮痛，還能緩解基質降解，如雙醋瑞因，可發揮抗炎、鎮痛作用，并促進軟骨修復。孫先潤等[3]研究顯示關節腔注射雙醋瑞因可顯著改善SD大鼠OA病理形態并提高二型膠原蛋白的表達。廖俊琳等[4]研究顯示1、10、100 μM雙醋瑞因顯著抑制白細胞介素-1β(IL-1β)誘導的軟骨細胞凋亡，但其作用機制尚不清楚。因此本課題主要探討雙醋瑞因是否可以抑制碘乙酸鈉(MIA)誘導的骨關節炎軟骨細胞損傷及其可能作用機制。

1材料與方法

1.1實驗動物雄性SD大鼠，體質量(100±20)g，購自上海斯萊克實驗動物有限公司，合格證SCXK(滬2012-0002)。室內溫度控制在(23±2)℃，大鼠自由飲食和攝水。

1.2試劑雙醋瑞因膠囊購自昆明積大制藥有限公司；碘乙酸鈉購自阿拉丁；兔抗Bax、Bcl-2、基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶-13(MMP-13)、pp65、IκBα、p-IκBα抗體購自Epitmics公司；鼠抗p65、GADPH抗體、半胱氨酸天冬氨酸蛋白酶-3(Caspase-3)檢測試劑盒購自碧云天生物技術研究所；Ⅱ型膠原酶，新生牛血清(NCS)，DMEM/F-12培養基購自Gibco公司。ChemiDocTM XRS凝膠成像系統購自Bio-Rad公司；Tecan Infinite F200/M200型多功能酶標儀購自瑞士TECAN集團公司。

1.3大鼠軟骨細胞的制備[1-2]無菌環境下，小心刮取SD大鼠雙側膝關節脛骨坪、股骨髁狀突及髕骨內側透明軟骨，充分漂洗軟骨小塊，用眼科剪剪碎至1 mm3大小。將軟骨碎片轉移至小錐形瓶中，依次用0.25%的胰蛋白酶及0.2%的膠原酶分別消化30 min 及2 h。膠原酶消化時每隔20 min振蕩1 min。將消化液經200目篩網過濾，以便得到單細胞懸液，1 000 rpm/min離心10 min。用DMEM/F-12培養基重懸細胞(含20% NCS，100 U/mL 青霉素，100 U/mL鏈霉素)，將細胞懸液轉移至干凈無菌的細胞培養瓶中，37 ℃5% CO2培養箱中培養，約48 h，細胞絕大部分貼壁，棄去未貼壁的細胞，更換新鮮的培養基繼續培養，約4～5 d細胞開始融合，實驗使用第2～3代細胞。

1.4軟骨細胞活力檢測采用噻唑藍(MTT)法，將第2～3代的軟骨細胞，用0.25%的胰蛋白酶消化細胞，用含10% NCS的DMEM/F-12培養基調整細胞濃度為每毫升1×105個，接種于96孔細胞培養板，37 ℃5% CO2培養箱中培養24 h，使細胞充分貼壁。加入含5% NCS的DMEM/F-12(含4 μM MIA及1、10、100 μM雙醋瑞因)培養基，37 ℃ 5% CO2條件下培養48 h，每孔加MTT(5 mg/mL)20 μL，繼續培養4 h后，小心吸出培養上清液，每孔加入DMSO 150 μL，待結晶充分溶解后，酶標儀570 nm處測定OD值。

1.5Caspase-3活性檢測將第2～3代軟骨細胞進行消化，調整細胞濃度為2×105/mL，接種于37 ℃ 5% CO2培養箱中培養24 h。加入含5% NCS的DMEM/F-12(含4 μM MIA及1、10、100 μM雙醋瑞因)培養基，繼續培養48 h。按Caspase-3分光光度法檢測試劑盒進行檢測。

1.6Western blot收集處理過的樣本，加入預冷的RIPA裂解液裂解，冰浴30 min，每隔10 min震蕩5 s，以1×104r/min 4 ℃離心15 min，獲得蛋白樣品。用BCA試劑盒檢測蛋白濃度。以每孔(30～50 ng)蛋白上樣，SDS凝膠電泳后濕法轉膜，以5%脫脂奶粉室溫封閉1 h加入一抗4 ℃孵育過夜。次日TBST漂洗3次，加二抗，室溫孵育1 h后漂洗3次。采用Bio-rad曝光系統進行曝光。

2結果

2.1雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞活力的影響與正常組比較，模型組中軟骨細胞活力顯著下降，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，雙醋瑞因低、中、高劑量組中軟骨細胞活力顯著上升，差異具有統計學意義(P<0.01)；說明1、10、100 μM雙醋瑞因對MIA誘導的大鼠軟骨細胞的活力具有保護作用(圖1)。

aa：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，bb：P<0.01，與模型組比較。

圖1雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞活力的影響

2.2雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞中NF-κB信號通路的影響骨與正常組比較，模型組中IκBα及NF-κB p65磷酸化水平顯著提高，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，雙醋瑞因中、高劑量組中IκBα及NF-κB p65磷酸化水平下降，差異具有統計學意義(P<0.01)；說明10、100 μM雙醋瑞因可通過NF-κB信號通路保護MIA誘導的大鼠軟骨細胞損傷(圖2)。

2.3雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞中細胞凋亡相關蛋白表達量的影響與正常組比較，模型組中Bax表達量上升，Bcl-2表達量下降，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，雙醋瑞因中、高劑量組中Bax表達量下降，Bcl-2表達量上升，差異具有統計學意義(P<0.05)；說明10、100 μM雙醋瑞因可通過抑制細胞凋亡蛋白從而抑制MIA誘導的大鼠軟骨細胞凋亡(圖3)。

aa：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，bb：P<0.01，與模型組比較。

圖2雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞中NF-κB信號通路的影響

aa：P<0.05，與正常組比較；bb：P<0.01，與模型組比較。

圖3雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞中細胞凋亡相關蛋白表達量的影響

aa：P<0.05，與正常組比較；bb：P<0.01，與模型組比較。

圖4雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞中基質金屬蛋白酶表達量的影響

2.4雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞中基質金屬蛋白酶表達量的影響與正常組比較，模型組中MMP-9及MMP-13表達量上升，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，雙醋瑞因中、高劑量組中MMP-9及MMP-13表達量下降，差異具有統計學意義(P<0.05)；說明10、100 μM雙醋瑞因可通過抑制MMPs從而抑制MIA誘導的大鼠軟骨細胞細胞外基質的降解(圖4)。

2.5雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞中Caspase-3活性的影響與正常組比較，模型組中Caspase-3活性顯著提高，差異具有統計學意義(P<0.01)；與模型組比較，雙醋瑞因低、中、高劑量組中Caspase-3活性顯著顯著降低，差異具有統計學意義(P<0.05)；說明1、10、100 μM雙醋瑞因可通過降低Caspase-3活性從而抑制MIA誘導的大鼠軟骨細胞凋亡(圖5)。

aa：P<0.05，與正常組比較；b：P<0.05，bb：P<0.01，與模型組比較。

圖5雙醋瑞因對MIA誘導的軟骨細胞中Caspase-3活性的影響

3討論

軟骨細胞是關節軟骨唯一的細胞，在軟骨形成、代謝以及修復中發揮重要作用。因此抑制軟骨細胞的凋亡，可顯著延緩OA進程。細胞因子、NO、能量代謝抑制劑(如MIA)等多種因素可引起軟骨細胞損傷乃至死亡，其中MIA為糖酵解途徑中3-磷酸甘油醛脫氫酶抑制劑，通過抑制細胞能量代謝而導致細胞因供養不足而死亡[5]。MIA體外刺激24 h能造成大鼠軟骨細胞的死亡[6]。本實驗亦表明MIA誘導24 h會降低軟骨細胞活力，1、10、100 μM雙醋瑞因可一定程度上抑制軟骨細胞活力的下降。

NF-κB 是一類能與多種基因啟動子或增強子部位 κB 位點發生特異性結合并促進其轉錄的蛋白質。正常生理狀態下，在細胞質中與IκB結合，受外界環境或上游信號刺激，即可脫離IκB，進入細胞核，與下游靶基因相應DNA位點結合，促使其進行轉錄。它可以調控多種靶基因，包括細胞凋亡蛋白Bax，Bcl-2，MMPs等[1-2]。在DBA/1小鼠早期OA和類風濕關節炎中發現軟骨細胞中NF-κB的核轉位異常[7]。在關節炎患者血清中NF-κB p65活性顯著提高[8]。用siRNA干擾NF-κB p65的表達，可減輕大鼠OA病理進程[9-10]，說明抑制NF-κB的活性成為治療OA的靶點。因此本實驗通過Western blot檢測各組中NF-κB的激活情況，發現了雙醋瑞因(10、100 μM)能顯著降低IκBα及NF-κB p65磷酸化水平，說明雙醋瑞因可通過抑制NF-κB信號通路，從而發揮其抗OA作用。

軟骨細胞的凋亡是OA中心環節。且軟骨細胞凋亡嚴格受到癌基因的調控。其中Bcl-2家族是最常見的癌基因，能與Bax亞家族相互作用，啟動軟骨細胞內的凋亡信號轉導，從而誘導細胞凋亡。研究已證實在關節炎患者血清中，Bax含量顯著上升，Bcl-2含量下降[11]，因此抑制此變化，一定程度也能緩解OA。本實驗證實雙醋瑞因提高OA軟骨細胞中Bcl-2的表達，降低Bax的表達，從而抑制軟骨細胞凋亡，達到治療OA的目的。通過抑制NF-κB信號通路，可使大鼠軟骨細胞Bax表達下降，Bcl-2上升，Caspase-3活性降低[1]。Caspase-3是一類進化上保守的天冬氨酸蛋白酶家族，依賴caspase的信號途徑是細胞凋亡的主要途徑。在OA患者中Caspase-3的表達高于正常，并隨著OA程度的加重Caspase-3的表達也增加[12]。通過使用Caspase-3抑制劑Z-DEVD-FMK可抑制IL-1β引起的軟骨細胞凋亡[13]。本實驗也證實雙醋瑞因可降低Caspase-3活性，從而抑制軟骨細胞凋亡。

正常生理狀態下，軟骨組織時合成代謝和分解代謝處于動態平衡，當分解代謝速度快于合成速度后，會導致MMPs的大量產生。MMPs是一個含有鋅指樣結構細胞外蛋白酶大家族，是迄今為止發現的唯一能分解纖維類膠原的酶，其中MMP-9屬于明膠酶類，MMP-13屬于膠原酶類。OA時MMP-9，MMP-13的表達明顯增高，導致關節軟骨細胞外基質二型膠原，蛋白多糖過度降解，破壞關節軟骨，使關節發生退變[14]。MMP-9、MMP-13表達量的下調，能顯著緩解OA進程[15]。同時NF-κB信號通路的失活可顯著抑制MMPs的表達[1-2]。因此本實驗通過Western blot檢測各組中MMPs的表達，證實了雙醋瑞因可通過下調MMP-9及MMP-13的表達，從而緩解OA時細胞外基質降解。

綜上所述，雙醋瑞因可提高MIA誘導的大鼠軟骨細胞活力并抑制Caspase-3活性，降低IκBα及NF-κB磷酸化水平，并下調Bax，MMP-9及MMP-13的表達，上調Bcl-2的表達。說明雙醋瑞因能通過NF-κB信號通路夠抑制MIA誘導的軟骨細胞凋亡與細胞外基質降解。

參考文獻

[1]Zhang XH,Xu XX,Xu T,et al.beta-Ecdysterone suppresses interleukin-1 beta-Induced apoptosis and inflammation in rat chondrocytes via inhibition of NF-kappa B signaling pathway[J].Drug Dev Res,2014,75(3):195-201.

[2]Zhang XH,Xu XX,Xu T.Ginsenoside Ro suppresses interleukin-1 beta-induced apoptosis and inflammation in rat chondrocytes by inhibiting NF-kappa B[J].Chin J Nat Med,2015,13(4):283-289.

[3]孫先潤，姚紹平，葉吉云，等.關節腔注射雙醋瑞因對SD大鼠骨關節炎形態及ED1和COL2表達的影響[J].中國矯形外科雜志，2014，22(6)：539-543.

[4]廖俊琳，王聲，劉日光.雙醋瑞因對白細胞介素1β誘導軟骨細胞凋亡的影響[J].中國組織工程研究，2012，16(7)：1161-1164.

[5]Wang XD,Kou XX,He DQ,et al.Progression of cartilage degradation,bone resorption and pain in rat temporomandibular joint osteoarthritis induced by injection of iodoacetate[J].PLoS One,2012,7(9):e45036.

[6]TongP,XuS,CaoG,etal.ChondroprotectiveactivityofadetoxicatedtraditionalChinesemedicine

(Fuzi) of Aconitum carmichaeli Debx against severe-stage osteoarthritis model induced by mono-iodoacetate[J].J Ethnopharmacol,2014,151(1):740-744.

[7]Song X,Shen J,Wen H,et al.Impact of schistosoma japonicum infection on collagen-induced arthritis in DBA/1 mice:a murine model of human rheumatoid arthritis[J].PLoS One,2011,6(8):e23453.

[8]郭靜，勾向博，張文麗，等.骨關節炎患者膝關節軟骨和滑膜中p38MAPK、NF-κB的表達及其意義[J].河北聯合大學學報:醫學版，2013，15(6)：749-751.

[9]Chen LX,Lin L,Wang HJ,et al.Suppression of early experimental osteoarthritis by in vivo delivery of the adenoviral vector-mediated NF-kappaBp65-specific siRNA[J].Osteoarthritis Cartilage,2008,16(2):174-184.

[10]陳連旭，于長隆.腺病毒介導核因子κBp65特異性小干涉RNA抑制骨關節炎[J].中國組織工程研究，2012，16(46)：8551-8555.

[11]Wang SJ,Guo X,Zuo H,et al.Chondrocyte apoptosis and expression of Bcl-2,Bax,Fas,and iNOS in articular cartilage in patients with Kashin-Beck disease[J].J Rheumatol,2006,33(3):615-619.

[12]Sena P,Manfredini G,Benincasa M,et al.Up-regulation of the chemo-attractive receptor ChemR23 and occurrence of apoptosis in human chondrocytes isolated from fractured calcaneal osteochondral fragments[J].J Anat,2014,224(6):659-668.

[13]Shakibaei M,John T,Seifarth C,et al.Resveratrol inhibits IL-1 beta-induced stimulation of caspase-3 and cleavage of PARP in human articular chondrocytes in vitro[J].Ann N Y Acad Sci,2007(1095):554-563.

[14]王維山，史晨輝，李長俊，等.OA 患者關節液 uPA 和 MMP-3，9，13，14的表達水平與關節功能的相關性研究[J].中國骨質疏松雜志，2014，20(6)：602-605,610.

[15]李衛平，蹇睿，胥方元.超聲波治療兔膝骨關節炎對MMP-1和MMP-13表達的影響[J].重慶醫學，2012，41(16)：1564-1566,封2.

Protective effect of diacerein on MIA-induced injury in rat osteoarthritis chondrocytes

Zhang Huidong

(Second Department of Orthopedics,Tangshan Municipal Workers Hospital,Tangshan,Hebei 063000,China)

[Abstract]ObjectiveTo investigate the protective effect of diacerein on monosodium iodoacetate (MIA) induced injury in rat osteoarthritis chondrocytes.MethodsThe experiment was divided into five groups,including the normal group,model group (4 μM MIA),diacerein low,middle and high doses groups (1,10,100 μM).The viability of chondrocytes was detected by MTT assay.The activity of cysteinyl aspartate specific proteinase-3 (Caspase-3) was measured by spectrophotography.The activation of nuclear factor kappa B (NF-κB) signaling pathway and expression level of downstream target molecule cell Bax,Bcl-2,matrix metalloproteinase-9 (MMP-9) and MMP-13 were detected by Western blot.Results1,10,100 μM diacerein could increase the viability of MIA-induced chondrocytes and reduce the activity of Caspase-3(P<0.05).10,100 μM diacerein could decrease the phosphorylation level of IκBα and NF-κB p65,furthermore downregulated the level of Bax,MMP-9 and MMP-13 protein,and upregulated the level of Bcl-2 protein (P<0.05).ConclusionDiacerein could inhibit cell apoptosis and degradation of extracellular matrix in MIA-induced rat chondrocytes,which might be related to the NF-κB signal pathway.

[Key words]ostearthritis;diacerein;chondrocytes;apoptosis,NF-κB signal pathway

doi:論著·基礎研究10.3969/j.issn.1671-8348.2016.08.004

作者簡介：張慧東(1970-)，學士，主治醫師，主要從事骨外科臨床的研究。

[中圖分類號]R684

[文獻標識碼]A

[文章編號]1671-8348(2016)08-1019-03

(收稿日期：2015-09-16修回日期：2015-11-08)