油茶內生拮抗菌的篩選與鑒定

姜 微，劉效辰，邱榮群，吳曉菲，溫錦濤，羅 娜，羅 瓊

(長沙醫學院生物技術教研室，湖南長沙 410219)

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油茶內生拮抗菌的篩選與鑒定

姜 微，劉效辰，邱榮群，吳曉菲，溫錦濤，羅 娜，羅 瓊*

(長沙醫學院生物技術教研室，湖南長沙 410219)

摘要[目的]通過對湖南長沙地區油茶內生拮抗菌的篩選，為油茶根腐病、葉枯病、炭疽病及軟腐病的生物防治提供理論依據。[方法]采用研磨法從健康油茶根、莖、葉組織中分離出內生菌，通過平板對峙試驗篩選出對油茶根腐病、葉枯病、炭疽病及軟腐病都具有拮抗活性的內生菌，并進行形態觀察和16S rDNA序列分析。[結果]不同組織內生細菌數量不同，根中內生細菌的數量最多，其次為莖，葉中最少。菌株J-3-1對油茶根腐病菌、葉枯病菌、炭疽病菌及軟腐病菌均有拮抗活性，其抑菌圈半徑分別為12.5、16.8、13.5、13.4 mm。16S rDNA相似性為99%。[結論]通過對該菌株進行形態觀察及16S rDNA序列分析，鑒定其為枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis)。

關鍵詞油茶；內生拮抗菌；分離鑒定

油茶根腐病、葉枯病、炭疽病和軟腐病是近年來發生頻繁且危害嚴重的油茶病害[1-2]，該病分布廣泛，可造成重大的經濟損失。內生菌具有在植物體內獨立自主的分裂繁殖和傳遞特性，可增強宿主對其他生物如病原細菌和真菌的抗性，分離并利用植物內生菌控制植物病蟲害、開發有益內生菌以提高作物產量和品質對于可持續農業具有重要意義。自20世紀中葉以來，國外在多種植物中分離得到了不同種屬的內生細菌[3]。近年來，對植物內生菌代謝物的生防物質研究取得了一定進展[4]。楊慧勇等[5]從銀杏上分離到一株病菌，該病菌的代謝產物對小麥赤霉病毒和紋枯病菌等植物病原真菌有很強的抑制作用[5]。陳敏等[6]從黃瓜根系內篩選出對黃瓜枯萎病具有一定拮抗能力的內生菌HE-1和HE-2。截至目前，對油茶病害主要采用化學防治，但大量化學農藥會影響油茶品質和茶園生態環境。筆者篩選出對油茶炭疽病、葉枯病、根腐病和軟腐病有強拮抗作用的內生細菌，為進一步開發應用生防菌資源防治油茶病害提供參考。

1材料與方法

1.1試驗材料于2014年10月在湖南省長沙市望城區采集健壯的油茶根、莖、葉樣品備用。

1.2基礎培養基NA培養基：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，瓊脂 15～20 g，自來水 1 000 mL，pH 7.0～7.2。NB培養基：牛肉浸膏 3 g，蛋白胨10 g，氯化鈉 5 g，自來水1 000 mL，pH 7.0～7.2 。PDA培養基：先洗凈去皮，再稱取300 g馬鈴薯切成小塊，加水煮爛(20～30 min，能被玻璃棒戳破即可)，用4層紗布過濾。葡萄糖 20 g，瓊脂 15～20 g，自來水 1 000 mL。

1.3試驗方法

1.3.1材料的消毒。取新鮮油茶的根、莖、葉，用自來水沖洗晾干后，各稱取1 g，用75%乙醇浸泡1 min， 再用2.5%的次氯酸鈉浸泡5 min，最后用無菌水沖洗3～ 4次。在無菌環境下，將最后一次沖洗液涂布于NA培養基上，26～28 ℃培養2 d，平板中若無菌落出現，則表示消毒徹底，若有，則需重新分離。

1.3.2菌懸液的制備。將消毒后的根、莖、葉分別放入無菌研缽中，吸取9 mL無菌水，將其研磨徹底后充分混勻，即為10-1的菌懸液，再依次進行梯度稀釋，根和莖的梯度為10-1、10-2、10-3、10-4，葉的梯度為10-1、10-2、10-3。

1.3.3內生菌的分離與種群密度測定。取各稀釋度的菌懸液0.1 mL分別涂布于NA培養基平板上，每個處理3 個平行。28 ℃恒溫培養2 d，分別計數。根據菌落形態(包括顏色、大小、形狀、透明度、表面光澤度、邊緣整齊度等)[7]，挑取具有代表性的單菌落，純化后斜面保存。

1.3.4內生拮抗菌的篩選[8]。將預先培養的病原真菌接種于PDA培養皿中心，采用兩點對峙的方法，在距PDA平板中心3 cm的2點上，分別接種內生菌，每個處理均設2個重復。將只接種病原菌不接種內生菌的處理設為空白對照，置于28 ℃恒溫箱中培養，每天觀察抑菌作用，用毫米刻度尺測量其內生菌與病菌菌落生長的相向半徑(R病)以及空白對照半徑(R0)，并計算抑制率。

病菌的生長抑制率=(R0-R病)/R0×100%

1.3.5PCR反應體系及擴增條件。 菌株用NB培養基振蕩培養過夜，用Tiangen細菌基因組DNA提取試劑盒提取菌株DNA，再進行PCR擴增。

引物為細菌16S rDNA通用引物，其序列(擴增片段大小約1 500 bp)為Univeirsal bacterial F：5′AGAGTTTGATCMTGGCTCAG-3′，Univeirsal bacterial R：5′-AAGGAGGTGWTCC-ARCC-3′。

PCR反應體系(25.0 μL)：2×powerTapMix 12.5 μL，去離子水9.5 μL，引物F 1.0 μL，引物R 1.0 μL，DNA模板1.0 μL。混勻后稍微離心。

PCR反應條件：95 ℃ 預變性5 min；95 ℃變性30 s，55 ℃退火0.5 min，72 ℃延伸1.5 min，30個循環；72 ℃延伸10 min，4 ℃保存。

取PCR擴增產物5 μL，用含GoldView的1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，電壓90 V，電泳30 min。在紫外分光儀下觀察并拍照。

1.3.6DNA序列測定和分析。擴增產物送至鉑尚生物技術有限公司進行測序，將測序結果在NCBI網站上(http：//www.ncbi.nlm.nih.gov)進行比對分析。

2結果與分析

2.1油茶不同組織內生菌的種群密度由圖1可知，油茶內生菌的種群密度在根中最高，約為2.10×104CFU/mg，莖中次之，約為2.20×103CFU/mg，葉中最低，約為1.1×102CFU/mg。

2.2內生細菌對油茶常見病原菌的拮抗效果由表1可知，菌株J-3-1對油茶葉枯病菌、炭疽病菌、軟腐病菌和根腐病菌均有較強的拮抗作用(圖2)，抑制圈半徑分別為16.8、13.5、13.4和12.5 mm，抑菌率分別為66.3%、71.0%、52.2%和65.2%。由此可見，菌株J-3-1對油茶常見病原菌拮抗作用較強，抑菌譜較廣，具有較好的生防應用潛力。

圖1　油茶不同組織內生菌的種群密度Fig.1　Population density of endophytic fungi in different tissues of oil-tea

表1內生細菌對油茶4種病原菌的抑菌效果

Table 1The antibacterial effect of endophytic bacteria on four kinds of common pathogens of oil-tea

菌株Strains病原菌Pathogenicbacteria抑制圈半徑Inhibitoryzoneradius∥mm抑菌率Inhibitionrate∥%J-3-1油茶葉枯病菌16.866.3J-3-1油茶炭疽病菌13.571.0J-3-1油茶軟腐病菌13.452.2J-3-1油茶根腐病菌12.565.2

注：a.炭疽病菌；b.根腐病菌；c.軟腐病菌。Note：a.Anthrax bacteria；b.Fusarium oxysporum；c.Bacteria erwinia.圖2　J-3-1對油茶常見病菌的拮抗效果Fig.2　Antagonistic effect of J-3-1 on common pathogen of oil tea

2.3內生拮抗菌16S rDNA PCR擴增及序列相似性分析由圖3可知，在1 500 bp左右產生明顯的條帶，條帶清晰且單一，與預期目標大小一致。將測序結果與基因庫(www.ncbi.nov.gov/blast)中的序列進行BLAST比對，結果表明該菌株為枯草芽孢桿菌(Bacillussubtilis)，16S rDNA相似性為99%。

注：M.DL2 000 DNA Marker。Note:M.DL2 000 DNA Marker.圖3　PCR 產物Fig.3　PCR products

3結論與討論

在分離植物內生菌的過程中，表面滅菌和分離培養條件是篩選內生菌的關鍵，表面滅菌不徹底會造成所分離的菌株不是內生菌，而表面滅菌過度會造成部分內生菌被殺死，最佳培養條件能最大限度地獲得較多的內生菌[9-10]。該試驗采用研磨法分離油茶內生菌，僅獲得14株菌株，與從其他一些植物，如馬鈴薯[11]、黃瓜[12]、大豆[13]等植物材料中篩選出100多株菌株相比，篩選的內生菌較少，這可能與油茶表面消毒有關。

該研究表明，根中油茶內生菌的種群密度最高，葉中最低，這說明微生物菌群密度與植株部位密切相關，這與相關研究[14]結果一致。內生細菌定殖在宿主植物各種組織和器官的細胞內和細胞間隙中，利用宿主細胞內或分泌到細胞間隙的分泌物或宿主防御反應的產物作為營養物質，而這些物質的產生與植物的生長部位有很大關系，這可能是造成同種植物不同部位內生菌數目有較大差異的主要原因。除植物本身外，菌群密度的不同可能還與分離內生菌的數量、滅菌時間的長短、消毒劑的滲入、培養基的選擇以及細菌對植物的吸附作用等因素有關[15]。

植物體內存在大量有益的內生細菌和內生真菌，這些內生菌在植物體中具有多種生物學功能，能提供植物所需的營養物質及某些激素，參與植物的防衛功能，促進植物快速生長，增強植物抗病、抗逆、抗動物危害的能力[16]。該研究從湖南長沙油茶中分離出一株內生細菌，該內生細菌對油茶常見的4種病原菌均有拮抗作用，經16S rDNA鑒定該內生細菌屬于枯草芽孢桿菌，16S rDNA相似性為99%。16S rDNA分子約為1 500 bp，只能提供部分基因組信息，所以要確定菌株的分類地位，還應結合胞壁分析、生理生化特征、G+C含量等最終確定[17]。

為了使拮抗菌的拮抗病菌效果更佳，更好地應用于生產，筆者將進一步探究拮抗菌與病菌的聯合條件(最適溫度、最適pH、最適拮抗菌濃度等)。

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Screening and Identification of Oil-tea Endophytic Antagonistic Bacteria

JIANG Wei, LIU Xiao-chen, QIU Rong-qun, LUO Qiong*et al

(Department of Biotechnology, Changsha Medical University, Changsha, Hunan 410219)

Abstract[Objective] Through screening out oil-tea endophytic antagonistic bacteria in Changsha, the aim was to provide a theoretical basis for biological control of root rot, leaf blight, anthracnose and soft rot disease. [Method] Using grinding method, endophytic bacteria was isolated from healthy root, stem and leaf of oil-tea. Through plate confrontation test, endophytic bacteria with antagonistic activity against oil-tea root rot, leaf blight, anthrax disease and soft rot disease was screened out, morphological observation and 16S rDNA sequence analysis was conducted. [Result] The quantity of endophytic bacteria in different tissues of oil-tea was root>stem>leaf. Strain J-3-1 had antagonistic activities against root rot, leaf blight, anthrax disease and soft rot disease, the inhibitory zone radius was 12.5, 16.8, 13.5 and 13.4 mm, 16S rDNA similarity was 99%. [Conclusion] By morphological observation and 16S rDNA sequence analysis, it is identified as Bacillus subtilis.

Key wordsOil-tea; Endophytic antagonistic bacteria; Isolation and identification

作者簡介姜微(1994- )，女，湖南湘潭人，本科生，專業：生物技術。*通訊作者，講師，碩士，從事內生固氮菌方面的研究。

收稿日期2016-03-07

中圖分類號S 188

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)08-125-03