一測多評法測定保健食品中6種大豆異黃酮類成分

李麗敏，程益清，楊盈盈，毛秀紅，季申（上海市食品藥品檢驗所，上海201203）

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一測多評法測定保健食品中6種大豆異黃酮類成分

李麗敏，程益清，楊盈盈，毛秀紅，季申
（上海市食品藥品檢驗所，上海201203）

摘要：建立一測多評方法實現只用一個對照品同時測定保健食品中6種大豆異黃酮類成分的含量，以解決含大豆異黃酮類成分保健食品對照品昂貴不易獲得的難題。樣品經甲醇超聲波輔助提取后，采用Waters XbridgeC18（150 mm× 4.6 mm，3.5μm）色譜柱，以2%乙酸和乙腈為流動相進行梯度洗脫，260nm并輔以DAD紫外檢測器檢測。通過5種待測成分與染料木苷的相對保留時間、DAD光譜及參照圖譜完成待測成分確認；通過研究確立其他5種待測成分與染料木苷的校正系數進行含量測定，一定線性范圍內得到不同濃度對照品在不同儀器、人員及色譜柱上的校正系數RSD為0.4%～3.5%；3批不同來源保健食品中6種大豆異黃酮類成分測定結果與常規外標法所得結果結果偏差為0.3%～5.8%；所建立的一測多評方法可用以大豆異黃酮及其相關保健食品的定量分析及質量評價方法。

關鍵詞：一測多評；含量測定；高效液相色譜；大豆異黃酮；保健食品

大豆異黃酮（Soybean isoflavones，ISO）是從大豆中提取分離的一類具雌激素作用的活性成分，屬黃酮類化合物中異黃酮類成分［1-2］，具有抗癌、抑制生物體內產生的活性氧等功能，在癌癥預防、保護心血管系統、改善和預防婦女更年期綜合癥等方面具有獨特作用［3］，近年來在保健食品領域應用較廣［4-5］。

大豆異黃酮包括染料木素、大豆黃素和黃豆黃素及其7-O-葡萄糖苷衍生物共12種［1］，用于保健食品原料的大豆異黃酮多含有大豆苷、黃豆黃素、染料木苷、大豆素、黃豆黃素苷元、染料木素6種成分，目前保健食品國家標準（GB/T23788-2009《保健食品中大豆異黃酮的測定方法高效液相色譜法》）中保健食品大豆異黃酮成分的檢測方法為高效液相色譜法測定上述6種成分［6］，但實際由于市場供應的高純度標準品價格昂貴且不易獲得，同時測定6種成分時不僅提高檢測成本且降低檢測效率。有研究者曾采用對照品替代法測定6種大豆異黃酮類成分，但其待測成分確認需采用質譜方法，分析成本較高［7］。“一測多評”法（quantitative analysis of multi-components by singlemarker，QAMS）是近年來中藥領域用于多成分質量控制的研究思路，它運用同系列成分間存在的內在函數比例關系，采用單個易獲得的對照品對多個成分進行定量，實現多個成分（對照品沒有或難以供應）的同步監控，目前已用于解決中藥質量控制中缺乏對照品這一瓶頸問題［8-9］。

本研究以染料木苷對照品為參照，采用高效液相色譜與二極管陣列檢測技術，通過確定準確的待測成分指認參數和校正系數，建立了保健食品中大豆異黃酮類成分的一測多評測定方法，實現以一種對照品同時測定6種大豆異黃酮類成分，達到降低檢驗成本、提高檢測效率的目的，可為含大豆異黃酮類保健食品的質量控制提供技術方案。

1　儀器與試藥

Agilent 1100液相色譜儀：安捷倫科技有限公司；乙腈、甲醇（色譜純）：Merck公司；乙酸（分析純）：上海化學試劑有限公司。

大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆素、黃豆黃素苷元和染料木素等對照品均購自中國食品藥品檢定研究院、北京百靈威科技有限公司和上海同天生化生物科技有限公司。

收集3個不同來源的市售大豆異黃酮類保健食品（見表1），方法學驗證均采用樣1作為研究對象。

表1　樣品來源及批號Table 1 The source and batch of samples

2　方法與結果

2.1對照品溶液的制備

取大豆苷、黃豆黃苷、染料木苷、大豆素、黃豆黃素苷元、染料木素對照品適量，配置成系列標準曲線溶液用以方法學研究。

另取染料木苷適量，加甲醇制成每1mL含染料木苷20 μg/mL的對照品溶液，用于一測多評法含量測定。

2.2供試品溶液的制備

取供試品粉末約0.2g，精密稱定，置50mL量瓶中，加入甲醇適量，超聲30 min使溶解，取出，放冷，用甲醇定容至刻度，搖勻，離心，取上清液，作為供試品溶液。

2.3色譜條件與分析方法

色譜柱：Waters XbridgeC18色譜柱（150mm×4.6mm，3.5 μm，沃特世科技有限公司），柱溫：25℃，檢測波長260 nm；以乙腈為流動相A，2%乙酸為流動相B，按表2進行梯度洗脫；分別精密吸取對照品溶液和供試品溶液各5 μL進樣分析。在此條件下，不同來源樣品中6種待測成分分離以及其與樣品中其他雜質峰分離符合要求，見圖1。

表2　流動相梯度洗脫表Table 2 The list of mobile phase gradient elution

圖1　保健食品中大豆異黃酮類分析色譜圖Fig.1 HPLC chromatogram of ISO in health food

2.4方法學考察

2.4.1線性關系考察

分別吸取6種大豆異黃酮對照品混合溶液，配置系列濃度，按照既定方法進樣分析，測定峰面積，以各成分的峰面積為縱坐標，含量為橫坐標，繪制標準曲線，結果表明，在給定范圍內線性關系良好，見表3。

表3　大豆異黃酮類成分線性關系及范圍Table 3 Regressive equation and liner of six ISOs

2.4.2重復性試驗

取樣1內容物粉末0.2 g，一式6份，按照2.2項，分析平行操作6份樣品中各待測成分含量及其RSD，考察方法重復性。結果表明方法重復性較好。

2.4.3供試品溶液的穩定性

取制備好的供試品溶液，分別于不同時間進樣，比較一定放置時間內各成分分面積變化，考察供試品溶液的穩定性，結果表明測定24 h內6種大豆異黃酮類成分峰面積RSD小于1%，供試品溶液在24 h內穩定。

2.4.4準確度試驗

取樣1粉末0.1 g，精密稱定，一式9份，置50 mL量瓶中，分別按照樣品中含有的大豆異黃酮類成分的80%、100%、120%精密加入混合對照品，作為低、中、高3種濃度加樣回收試驗，每個濃度點各3份，按照

2.2項下分析，進行低、中、高3個濃度水平的準確度試驗，結果表明見表4。

表4　方法學試驗結果Table 4 The result of method validation

供試品中6種待測成分的加樣回收率均在95%～105%之間，方法準確可靠。

2.4.5檢測限與定量限

取經一定比例稀釋后混合對照品，進樣，計算各色譜峰信噪比，以3倍和10信噪比時分別作為最低檢測限和最低定量限；再按照供試品含量計算公式分別計算得出方法最低檢出限及方法最低定量限（定容體積50 mL，稱樣量0.2 g），結果見表4。

2.4.6中間精密度

采用不同儀器、不同色譜柱，由不同人員按照擬訂的方法進行試驗，考察方法的中間精密度，評價方法耐用性，結果表明，既定條件下，方法耐用性較好。2.4.7一測多評方法研究

染料木苷對照品易獲得，且其出峰時間適中，故以染料木苷作為參照峰，以相對保留時間進行其他色譜峰確認，通過確定待測成分與染料木苷的校正系數，計算待測成分含量。

2.4.7.1相對保留時間及待測成分確認研究

采用不同液相色譜及不同品牌色譜柱考察6種待測成分保留時間，以染料木苷為參照計算相對保留時間，結果見表5。

表5　相對保留時間結果Table 5 The result of relative retention time

待測成分的相對保留時間較穩定，RSD均小于5%，以不同條件得到的平均相對保留時間，并設定10%的偏差范圍，可作為待測成分確認指標。

2.4.7.2校正系數的確定

分別由兩位分析人員對收集到的2個不同來源的6種大豆異黃酮對照品按照低、中、高濃度范圍的配置4組標準系列溶液（每組n=6）；分別在不同儀器、不同色譜柱等條件下分析，得出各待測成分校正因子，計算其與染料木苷的校正系數。最終得到108個數據，采用依拉格法進行可疑值的剔除，計算平均值（X）及樣本總體標準偏差（SD），以X±3SD為可信范圍，超出即為可疑值，予以剔除，結果表明108個數據中無可疑值，說明分析中得到的校正系數誤差較小，最終以平均值作為一測多評方法含量計算校正系數，見表6。

表6　校正系數測定結果Table 6 The result of the correction coefficient

2.4.7.3一測多評方法準確性驗證

3批樣品中按照確定的校正系數計算6種大豆異黃酮含量，并與常規對照品法進行比較，驗證一測多評校正系數準確性，結果表明一測多評計算結果與對照品法接近，偏差小于6%，見表7。

表7　一測多評法與常規對照品法結果比較Table 7 Comparison of contents of ISO in health foods by two methods

3　討論

3.1一測多評方法研究的影響因素

一測多評方法應用時通過與參照物的相對保留時間進行待測成分指認，保留時間受色譜柱、儀器等因素影響較大，因此建立方法時應全面考察影響因素，并對保證方法耐用性的參數進行明確［10］。

3.1.1相對保留時間及準確待測成分指認

考察了不同色譜柱及儀器，結果表明必需明確規定色譜柱填料、粒度、長度、粒徑等參數，才能保證既定條件下相對保留時間在一定范圍內穩定；研究中發現大豆苷與大豆黃苷、大豆素與大豆黃素的相對保留時間范圍交叉覆蓋，僅相對保留時間指標難以精確指認待測峰，因此需給出方法參照圖譜，以便給分析人員明確待測成分色譜峰出峰順序及其與雜質峰分離情況，同時結合DAD光譜圖信息在245 nm～265 nm具有最大吸收峰的條件設置，可準確確定待測成分。

3.2校正系數

待測成分校正系數需要大量全面的數據考察，對照品來源、純度、不同濃度、人員配置偏差等可能會帶來的誤差均會影響最終結果，進而影響方法準確性，同時儀器、色譜柱等因素也可能帶來一定偏差，因此研究中全面考慮各種因素可能帶來的誤差，考察了不同來源、不同濃度、不同人員、不同儀器和不同色譜柱的校正系數，得到較為全面的試驗數據，進行統計分析，以確保方法耐用性和準確性。

3.2一測多評方法應用的實際意義

目前有關大豆異黃酮含量測定共均采用對照品外標法測定測定6種大豆異黃酮類成分［6，11］，但大多數保健食品企業由于對照品昂貴、不易獲得，在企業標準中僅設定其中1種成分限量，個別企業最多也僅設定大豆苷、大豆素，染料木苷和染料木素4種成分；大豆異黃酮成分不同致使性質有所差異，進而其在體內作用也會有所不同［12］，對照的不易獲得制約了產品質量控制設定合理質控指標，一測多評方法的建立可為各生產企業在其質量標準中明確規定大豆異黃酮類成分的含量限度提供方法依據，利于甄別產品質量優劣和進行質量控制。

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A Quantitative Method Using One Marker for Simultaneous Assay of Soybean Isoflavones in Health Food

LI Li-min，CHENG Yi-qing，YANG Ying-ying，MAO Xiu-hong，JI Shen
（Shanghai Institute for Food and Drug Control，Shanghai 201203，China）

Abstract：A quantitative analysis method of multi-components with single marker（QAMS）was established and validated to simultaneously determine six Soybean isoflavones（ISO）in health foods，which can solve the dilemma of natural chemical reference substances are expensive and unavailable. The samples were ultrasonicassisted extracted with methanol，the column was Waters XbridgeC18（150 mm×4.6 mm，3.5 μm），using 2% acetic acid and acetonitrile as the mobile phase with gradient elution，260 nm and with DAD detection was used. The component to be measured were confirmed by DAD spectrum，reference chromatogram and the relative retention time of genistin. The relative correction factors（RCF）of the other five soybean isoflavones were determined within the linear ranges，the RCF had a good reproducibility in various instruments，chromatographic columns（RSD = 0.4%-3.5%）. According to their RCF，six ISO in health food could be quantified.The results of QAMS method were validated by comparing with that of external standard method by quantified three different sources of health food，and the relative average deviation of the two method were 0.3%-5.8%. The method can be used for the quantitative analysis and quality evalution for ISOs and its related health food.

Key words：quantitative analysis method of multi-components with single marker（QAMS）；assay；HPLC；soybean isoflavones（ISO）；health food

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.040

作者簡介：李麗敏（1975—），女（漢），副主任藥師，碩士，主要從事中藥及保健食品檢測方法及質量標準研究。

收稿日期：2015-03-10