食品中克羅諾桿菌的分離和鑒定

黃啟紅，蔡大川，張志軍，方軍，陳敏兒，黃璇瑩，伍玲燕，熊娟，簡艷婷（中國廣州分析測試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東廣州510070）

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食品中克羅諾桿菌的分離和鑒定

黃啟紅，蔡大川，張志軍，方軍，陳敏兒，黃璇瑩，伍玲燕，熊娟，簡艷婷
（中國廣州分析測試中心廣東省化學(xué)危害應(yīng)急檢測技術(shù)重點實驗室，廣東廣州510070）

摘要：利用國標(biāo)方法對食品（蔬菜，熟食和豆制品）進(jìn)行了克羅諾桿菌的污染情況調(diào)查及其分離菌株的鑒定；利用fusA基因?qū)Ψ蛛x的克羅諾桿菌進(jìn)行了遺傳多樣性分析，將克羅諾桿菌屬的分離株鑒定到種的水平。主要取得了以下結(jié)論和認(rèn)識：①39份食品（蔬菜23份，熟食14份和豆制品2份）中有14份樣品檢出了克羅諾桿菌，檢出率為35.9%。蔬菜類檢出8份（34.8%），熟食制品檢出4份（28.6%），2份豆制品都檢出（100.0%）；②對14株克羅諾桿菌分離株進(jìn)行基于fusA基因的系統(tǒng)進(jìn)行分析，結(jié)果顯示這些分離株包括C. Sakazakii和C. malonaticus 2個種，其中C. sakazakii有9株，C. malonaticus有5株。

關(guān)鍵詞：食品；克羅諾桿菌；分離；種的鑒定

食品安全問題是關(guān)系到國民健康的重大民生問題。克羅諾桿菌（Cronobacter spp.）是近年來倍受關(guān)注的重要食源性致病菌，能引起新生嬰幼兒腦膜炎、菌血癥和小腸結(jié)腸炎等嚴(yán)重疾病，致死率高達(dá)30%～80%。流行病調(diào)查表明克羅諾桿菌感染與嬰幼兒配方奶粉密切相關(guān)，但目前克羅諾桿菌在自然界的污染源仍然不清楚。鑒于這種情況，本論文通過研究在廣州肉菜市場采集不同類型的食品（蔬菜、熟食和豆制品）利用國標(biāo)方法進(jìn)行克羅諾桿菌隨機(jī)抽樣檢測。克羅諾桿菌屬的7個種的毒性之間有差異，并不是所有的種都與感染相關(guān)，只有阪崎克羅諾桿菌、丙二酸鹽克羅諾桿菌和蘇黎世克羅諾桿菌與新生兒感染相關(guān)［1］。因此，將這個新屬的細(xì)菌鑒定到種的水平具有重要意義。本論文用最近國際上新建立的基于fusA的序列分析技術(shù)將分離菌株鑒定到種的水平，可以了解食品中該屬種的分布情況，從而確定其毒性，掌握該菌的污染規(guī)律，可為控制該菌爆發(fā)提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，對提升食品安全水平具有重要意義。

1　材料與方法

1.1檢測樣本

39份樣品分別來源于2013年6月～8月從廣州越秀區(qū)的集貿(mào)市場采集蔬菜類、熟食制品類和豆制品。具體樣品包括蔬菜類23份（2份小白菜，2份通菜，大黃瓜、大蔥、椰菜、香菜、油麥菜、蔥、辣椒圈、韭菜、芥菜、包菜、番薯葉、小塘菜、生菜、潺菜、大青菜、大頭菜、番茄、茄子、竹筍各1份）；熟食制品14份（某品牌鴨腿、某品牌烤雞腿、某品牌黑鴨鴨翅、某品牌鴨脖、香辣雞扒、某品牌雞腿、某品牌原味腸、某品牌雞翅、雞肉粉、炒青菜、熟魚、熱牛腩、紅燒豆腐、豆角炒叉燒）和豆制品2份（豆皮和嫩豆腐）。

1.2設(shè)備

SHP-250型生化培養(yǎng)箱：上海一恒科技有限公司；DXY-33A電泳儀：北京六一儀器廠；ImageQuant 350 system UVP凝膠成像儀：美國GE Healthcare公司；TProfessional thermocycler PCR儀：德國Biometra公司。1.3試劑及培養(yǎng)基

改良月桂基硫酸鹽胰蛋白胨肉湯-萬古霉素：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；阪崎顯色培養(yǎng)基：法國科瑪嘉公司；阪崎腸桿菌生化試劑鑒定盒：廣東環(huán)凱微生物科技有限公司；GoldViewTM Nucleic Acid Stain：北京賽百盛基因技術(shù)有限公司；細(xì)菌基因組DNA快速提取試劑盒、2×PCR DSMix：廣州東盛生物工程有限公司。

1.4方法

主要根據(jù)GB 4789.40-2010《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn)食品微生物學(xué)檢驗阪崎腸桿菌檢驗》第一法進(jìn)行檢驗，分離后進(jìn)行fusA擴(kuò)增引物和測序引物合成，進(jìn)一步進(jìn)行克羅諾桿菌基因組DNA的提取、PCR擴(kuò)增、產(chǎn)物測序、最后進(jìn)行序列分析比對，構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，將分離菌株鑒定到種。

2　結(jié)果

2.1不同樣品類型檢測結(jié)果

本研究共采集39份樣品（蔬菜類23份，熟食制品14份和豆制品2份），其中有14份樣品檢出了克羅諾桿菌，檢出率為35.9%。蔬菜類檢出8份（34.8%），熟食制品檢出4份（28.6%），2份豆制品都檢出（100.0%）結(jié)果見圖1。共分離到14株克羅諾桿菌（H1-H14）。

2.2克羅諾桿菌分離株的種水平鑒定中PCR基因擴(kuò)增結(jié)果

圖1　不同樣品類型檢測結(jié)果Fig.1 Samples of different types of test results

提取到的14株克羅諾桿菌分離株DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，將擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行凝膠電泳，結(jié)果可以看出所有分離株都擴(kuò)增出目標(biāo)基因預(yù)期片段大小1 300 bp左右結(jié)果見圖2，可以進(jìn)行測序。

圖2　14株克羅諾桿菌分離株的fusA基因擴(kuò)增結(jié)果Fig.2 The fusA gene amplification results that 14 grams of Cronobacter spp. isolates

2.3構(gòu)建進(jìn)化樹

將本實驗中分離出來的14株克羅諾桿菌的fusA基因和相關(guān)菌株的fusA基因序列進(jìn)行比對，這些fusA基因序列可以從GenBank軟件上下載得到，再用ClustalX軟件進(jìn)行比對，從而構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，見圖3。從進(jìn)化樹可以比對出，這些分離株包括C. Sakazakii和C. malonaticus 2個種，其中C. sakazakii有9株，C. malonaticus有5株。

3　討論

本文調(diào)查了39份樣品，克羅諾桿菌在這些食品的污染率較高，高達(dá)35.9%，連熟食中的污染率都高達(dá)28.6%。克羅諾桿菌在煮熟的情況下會被殺滅，這些熟食在蒸煮或油炸過程中克羅諾桿菌已被殺滅，而實際檢測結(jié)果卻證明這些熟食含有克羅諾桿菌。熟食制品的克羅諾桿菌污染應(yīng)該來源于做熟后的操作，也叫二次污染，比如在熟食蒸煮或油炸后放置熟食的器皿，后期加工時用的砧板、刀具、擦拭工具的抹布或是操作人員的手等都可能造成污染。

分離株的種水平鑒定結(jié)果顯示食品中克羅諾桿菌分離株的優(yōu)勢菌種為阪崎克羅諾桿菌，這與國際上其他的有關(guān)克羅諾桿菌本身的鑒定結(jié)果和分型的研究一致［2-3］。出現(xiàn)此類情況一方面原因可能是由于環(huán)境中阪崎克羅諾桿菌的分布范圍廣，從而容易成為奶粉或其他食品的污染源。

圖3　基于fusA基因構(gòu)建的克羅諾桿菌系統(tǒng)發(fā)育樹Fig.3 The Cronobacter spp. phylogenetic trees based on fusA gene

參考文獻(xiàn)：

［1］Kucerova E，Clifton S W，Xia X Q，et al. Genome sequence of Cronobacter sakazakii BAA-894 and comparative genomic hybridization analysis with other Cronobacter species［J］. PLoS One，2010（5）：9556

［2］Iversen C，Lehner A，Mullane N，et al. The taxonomy of Enterobacter sakazakii：proposal of a new genus Cronobacter gen. nov. and descriptions of Cronobacter sakazakii comb. nov. Cronobacter sakazakii subsp. sakazakii，comb. nov.，Cronobacter sakazakii subsp. malonaticus subsp. nov.，Cronobacter turicensis sp. nov.，Cronobacter muytjensii sp. nov.，Cronobacter dublinensis sp. nov. and Cronobacter genomospecies 1［J］. BMC Evol Biol，2007（7）：64

［3］Xu X，Wu Q，Zhang J，et al. Occurrence and Characterization of Cronobacter spp. in Powdered Formula from Chinese Retail Markets ［J］. Foodborne Pathog Dis，2014（5）：1180-1185

Isolation and Identification of Cronobacter spp. in Foods

HUANG Qi-hong，CAI Da-chuan，ZHANG Zhi-jun，F(xiàn)ANG Jun，CHEN Min-er，HUANG Xuan-ying，WU Ling-yan，XIONG Juan，JIAN Yan-ting
（Guangdong Provincial Key Laboratory of Emergency Test for Dangerous Chemicals，China National Analytical Center，Guangzhou，Guangzhou 510070，Guangdong，China）

Abstract：The method of national standard was used to detect the occurrence of Cronobacter spp. From food （milk，vegetables，cooked and soy）and further identified the isolation strain. FusA gene was used to analyze the genetic diversity of separated Cronobacter spp.，which can identify species. This paper mainly has made the following conclusions and cognition：①There are 39 other foods（23 vegetables，14 cooked food and 2 of soy product）test too，14 of which detected Cronobacter spp.，in a rate of 35.9%. Vegetables were detected in 8 （34.8%），food products were detected in 4（28.6%），2 copies of soy products are detected（100.0%）.②Based on fusA gene，the genetic diversity was analyzed for 14 Cronobacter spp.，the result indicated that there are 9 C. sakazakii，and 5 C. malonaticus among these isolates.

Key words：foods；Cronobacter spp.；detection；characterization

DOI：10.3969/j.issn.1005-6521.2016.09.046

基金項目：動物源性食品安全檢測技術(shù)研究和公共服務(wù)平臺（粵科規(guī)財字［2014］208號）；廣東省專業(yè)鎮(zhèn)中小微企業(yè)服務(wù)平臺建設(shè)項目（2013B091604003）

作者簡介：黃啟紅（1979—），女（漢），助理研究員，碩士，主要從事微生物檢驗與分析研究。

收稿日期：2015-03-05