犬博卡病毒PCR檢測方法的建立及其應用

陳意偉， 溫肖會， 朱學良， 呂殿紅， 翟少倫*， 魏文康*

(1.華中農業大學動物醫學院，湖北武漢 430070；2.廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

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犬博卡病毒PCR檢測方法的建立及其應用

陳意偉1,2， 溫肖會2， 朱學良2， 呂殿紅2， 翟少倫2*， 魏文康2*

(1.華中農業大學動物醫學院，湖北武漢 430070；2.廣東省農業科學院動物衛生研究所/廣東省畜禽疫病防治研究重點實驗室，廣東廣州 510640)

摘要[目的]建立犬博卡病毒(Canine bocavirus，CBoV)的PCR檢測方法，了解其流行情況。[方法]根據GenBank數據庫上CBoV的VP2基因序列合成1對引物，建立PCR檢測方法，并運用該方法對臨床樣品進行檢測。[結果]特異性試驗中，除CBoV有目的條帶出現外，犬細小病毒(CPV)、犬瘟熱病毒(CDV)、犬傳染性肝炎(ICHV)、犬副流感病毒(CPIV)、貓瘟熱(FDV)等均無條帶出現。敏感性試驗表明，此檢測方法對CBoV的最低檢測量為4.806 2 pg/μL。重復性試驗表明，多次重復試驗結果一致，表明此方法重復性好。425份樣品中僅有1份樣品擴增出目的條帶，經測序比對鑒定為CBoV。初步的流行病學調查結果表明，CBoV在犬中的流行率與感染率極低。[結論]建立的PCR檢測方法具有特異性強、敏感性高、可重復性強等特點。

關鍵詞犬博卡病毒；PCR檢測方法；應用

犬博卡病毒(Canine bocavirus，CBoV)隸屬細小病毒科細小病毒亞科博卡病毒屬，為單股線狀無囊膜的DNA病毒。2005年，瑞典學者Allander等[1]從1份嬰幼兒病例樣本中分離并鑒定出此種病毒，命名為人博卡病毒(Human bocavirus,HBoV)。后來，牛博卡病毒、犬博卡病毒、豬博卡病毒、大猩猩博卡病毒、黑猩猩博卡病毒相繼被發現[1-2]。雖然博卡病毒最先在患有肺炎的嬰幼兒上呼吸道中被檢測到，但后來的大量樣品檢測結果發現腹瀉樣品中博卡病毒的陽性率更高[3]。博卡病毒可感染并導致宿主發生急性腹瀉[3-7]。近年來，人博卡病毒(HBoV)和豬博卡病毒(PBoV)各種基因型的分離與鑒定、檢測方法、流行病學調查等日趨成熟全面[7-18]。犬博卡病毒(CBoV)在這些方面的研究資料比較欠缺[19-22]。為了解CBoV在犬類中的流行情況，筆者建立了犬博卡病毒的PCR檢測方法，并應用此檢測方法對廣州地區犬博卡病毒的流行情況進行初步調查，旨在為今后CBoV的研究提供一些依據。

1材料與方法

1.1重組質粒、病毒及樣品含有CBoV-VP2基因的重組質粒，由廣東省農業科學院動物衛生研究所診斷中心構建；犬細小病毒(CPV)由廣東省農業科學院動物衛生研究所生物技術中心提供；犬瘟熱病毒(CDV)、犬傳染性肝炎(ICHV)、犬副流感病毒(CPIV)以及貓瘟熱(FDV)細胞分離上清液由廣東省農業科學院動物衛生研究所動物疫病診斷中心保存、樣品由廣東省農業科學院動物衛生研究所動物疫病診斷中心采集保存。所有DNA提取均按照AXYGEN公司的核酸提取試劑盒說明操作。

1.2引物設計根據GenBank數據庫中的犬博卡VP2基因序列設計1對引物，上游引物為5′-TTCTTTTTCCTTTGACTGCGGG-3′；下游引物為5′-GCGAGTGTGCGTCTAATCTGCT-3′，目的片段大小為410 bp，交由上海生工生物工程股份有限公司廣州分部合成。

1.3標準陽性質粒的構建經CBoV-VP2引物擴增出的基因目的序列，用E.Z.N.A Gel Extraction Kit純化，產物連接到pMD19-T載體，轉化到Top10感受態細胞，再交由上海生工生物工程股份有限公司廣州分部測序。

1.4PCR方法的建立

1.4.1PCR反應條件的優化。PCR反應體系(25 μL)：2×TaqPCR MasterMix 12.5 μL、ddH2O 8.5 μL、DNA模板 3 μL、上下游引物各0.5 μL。PCR反應條件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，52 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 10 min。

(1)退火溫度的優化。以克隆陽性質粒為DNA模板，退火溫度設置為52～60 ℃,根據擴增效果篩選出最佳退火溫度。

(2)引物用量的優化。以克隆陽性質粒為DNA模板，采用不同的引物用量(0.1～2.0 μL)進行擴增，篩選最佳引物用量。

1.4.2特異性試驗。對PCR反應條件進行優化后，分別擴增CDV、CPV、ICHV、CPIV和FDV，以驗證該引物的特異性。

1.4.3敏感性試驗。用克隆質粒為標準陽性對照，檢測該方法的敏感性。先測定質粒濃度，然后做10倍倍比稀釋擴增體系(10-10～100)。

1.4.4重復性試驗。將敏感性試驗中所稀釋的每個倍比數重復擴增3次以上，以驗證該方法的重復性。

1.5臨床樣品的檢測從廣州某犬繁育場采集425份糞便樣品，用1 mL PBS液體稀釋后混勻，離心后取上清液，按照AXYGEN公司的核酸提取試劑盒說明操作提取DNA。運用優化的PCR方法對采集樣品進行檢測。

2結果與分析

2.1PCR方法的優化

2.1.1退火溫度的優化。從圖1可以看出，當退火溫度為55 ℃時擴增效果最佳，因此最佳退火溫度為55 ℃。

2.1.2引物用量的優化。從圖2可以看出，當引物用量為1.0 μL時擴增效果最佳，因此最佳引物用量為1.0 μL。

注：M.DL2000 DNA Marker；1.60 ℃；2.59.4 ℃；3.58.4 ℃；4.56.9 ℃；5.55.1 ℃；6.53.5 ℃；7.52.5 ℃；8.52 ℃。Note：M.DL 2 000 DNA Marker; 1.60 ℃; 2.59.4 ℃; 3.58.4 ℃; 4.56.9 ℃; 5.55.1 ℃; 6.53.5 ℃; 7.52.5 ℃; 8.52 ℃.圖1　退火溫度的優化結果Fig.1 The optimization results of annealing temperature

注：M.DL2000 DNA Marker;1～20依次為0.1～2.0 μL。Note：M.DL 2000 DNA Marker; 1～20.0.1～2.0 μL.圖2　引物用量的優化結果Fig.2　The optimization results of primer dosage

注:M.DL2000 DNA Marker；1.CDV;2.CPV;3.ICHV;4.CPIV;5.FDV;6.CBoV。Note：M.DL2000 DNA Marker; 1.CDV; 2.CPV; 3.ICHV; 4.CPIV; 5.FDV; 6.CBoV.圖3　特異性試驗結果Fig.3　The specific test results

因此，PCR的最優反應條件如下：95 ℃ 5 min；95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，40個循環；72 ℃ 10 min。

2.2特異性試驗運用以上優化的PCR方法分別擴增CDV、CPV、ICHV、CPIV、FDV和CBoV，結果發現只有CBoV可以擴增出目的片段，表明該PCR方法具有良好的特異性(圖3)。

2.3敏感性試驗克隆質粒的初始濃度為480.62 ng/μL，對其進行10倍倍比稀釋(10-10-100)，進行敏感性試驗，結果發現該方法對DNA的最低檢測量為4.806 2 pg/μL(圖4)。

2.4重復性試驗將敏感性試驗中的每個倍比數重復擴增3次以上，結果均一致，表明該方法的重復性較好。

2.5臨床樣品的檢測運用優化后的PCR方法對臨床采集的425份樣品進行檢測，結果發現僅有1份為陽性，經測序鑒定為CBoV。

3討論與結論

迄今為止，研究表明博卡病毒對動物具有致病性，但同時也有研究人員從健康犬中檢測到博卡病毒[23]。自2005年博卡病毒被發現以來，國內對博卡病毒的研究大多集中在人博卡病毒和豬博卡病毒，犬博卡病毒在這方面的研究甚少。該研究中優化的PCR檢測方法對犬博卡病毒的最低檢測量

注：M.DL2000 DNA Marker；1.100;2.10-1;3.10-2;4.10-3;5.10-4;6.10-5;7.10-6;8.10-7;9.10-8;10.10-9;11.10-10。Note: M.DL2000 DNA Marker; 1.100; 2.10-1; 3.10-2; 4.10-3; 5.10-4; 6.10-5; 7.10-6; 8.10-7; 9.10-8; 10.10-9;11.10-10.圖4　敏感性試驗結果Fig.4　The sensitivity test results

為4.806 2 pg/μL，在425份被檢樣品中沒有出現任何非特異性條帶，表明該檢測方法具有良好的特異性。在初步的流行病學調查中，425份樣品中僅檢測出1份為陽性，此次檢測的樣品采集時間為8～12月。其中，被檢出的陽性樣品為8月從1只成年貴賓犬的糞便中所采集的。此次初步調查發現，博卡病毒目前在犬中的流行率和感染率極低，對犬暫時不構成致病性。但是，由于采樣對象和區域的局限性，并不能說明更大范圍犬博卡病毒的流行情況。

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Establishment and Application of a PCR Detection Method for Canine Bocavirus

CHEN Yi-wei1,2,WEN Xiao-hui2,ZHU Xue-liang2,ZHAI Shao-lun2*,WEI Wen-kang2*et al

(1.College of Animal Science,Huazhong Agricultural University,Wuhan,Hubei 430070; 2.Institute of Animal Health,Guangdong Academy of Agricultural Sciences/Guangdong Key Laboratory of Animal Disease Prevention,Guangzhou,Guangdong 510640)

Abstract[Objective] The aim was to establish canine bocavirus PCR detection method and study its prevalence.[Method] A pair of primers were synthesized according to the sequence of VP2 gene of CBoV on Genbank database,and the PCR detection method was established and was applied for detection of clinical sample.[Result] In specific tests,except for CBoV with the emergence of the band,CPV,CDV,ICHV,CPIV,FDV and so on were not brought to appear.Sensitivity experiments showed that the minimum detection amount of CBoV was 4.806 2 pg/μL.The results of repeated experiments were consistent,indicating that the method was reproducible.Among 425 samples,1 sample was amplified with the target bands,and the result was determined as CBoV.Preliminary epidemiological survey showed that the prevalence rate and infection rate of CBoV in dogs was very low.[Conclusion] The established detection method has characteristics of strong strong specificity,high sensitivity and strong repeatability.

Key wordsCanine bocavirus; PCR detection assay; Application

基金項目廣東省科技計劃項目(2012B090600048,2013B050800022,2013B040300009,2015A040404034,2015B050501007,2015-08020055)。

作者簡介陳意偉(1990- )，男，湖北襄陽人，碩士研究生，研究方向：動物疫病預防與診斷。*通訊作者，翟少倫，助理研究員，博士，從事動物疫病診斷技術研發。*通訊作者，魏文康，研究員，博士，碩士生導師，從事動物疫病診斷技術研發。

收稿日期2016-03-11

中圖分類號S 852.65+5

文獻標識碼A

文章編號0517-6611(2016)10-148-02