喉鱗狀細胞癌患者視網膜母細胞瘤蛋白和細胞周期調節蛋白D1異常表達

曾漢榮　楊虹女　李文星　涂　興　李志華　孔維佳

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喉鱗狀細胞癌患者視網膜母細胞瘤蛋白和細胞周期調節蛋白D1異常表達

曾漢榮1楊虹女1李文星2涂興3李志華2孔維佳3

【摘要】目的：探討喉鱗狀細胞癌(LSCC)患者視網膜母細胞瘤蛋白(pRb)和細胞周期調節蛋白D1(Cyclin D1)的異常表達及其相關性。方法：選擇36例喉部疾病手術患者，包括LSCC(LSCC組)、聲帶息肉(息肉組)和癌前病變(癌前組)各12例，各組均于手術后取病變組織，采用Western-blotting檢測pRb和Cyclin D1蛋白表達水平，統計學分析各組兩指標差異及相關性。結果：與息肉組比較，癌前組pRb表達水平降低(P<0.01)，Cyclin D1表達水平升高(P<0.01)；與癌前組比較，LSCC組pRb水平更低(P<0.01)，Cyclin D1水平更高(P<0.01)。三組pRb與Cyclin D1蛋白水平均呈顯著負相關(r分別為-0.94、-0.83和-0.92，P均<0.01)。結論：LSCC的發生和發展與pRb表達降低和Cyclin D1表達增加有關。

【關鍵詞】喉鱗狀細胞癌；視網膜母細胞瘤蛋白；細胞周期調節蛋白D1

喉癌(Laryngeal Carcinoma, LC)是耳鼻咽喉-頭頸外科常見惡性腫瘤，占全身惡性腫瘤的5.7%-7.6%，以喉鱗狀細胞癌(Laryngeal Squamous Cell Carcinoma, LSCC)最多，約占LC的96%-98%，死亡率高[1]。吸煙、酗酒、環境污染、病毒感染等多種因素是LSCC發生的主要原因，其分子生物學機制可能與原癌基因的激活及腫瘤抑制基因失活、轉錄失調等密切相關[2]。視網膜母細胞瘤蛋白(Retinoblastoma Protein, pRb)是一種重要的腫瘤抑制因子，在多種腫瘤中發生突變或缺失[3]，當致瘤RNA取代轉錄因子E2f，占據pRb口袋時，即破壞pRb正常功能，削弱pRb/E2f調控細胞增殖作用。細胞周期調節蛋白D1(Cyclin D1)是一種生長因子感受器和細胞周期正向調控因子[4]，負責細胞周期進展中G1/S轉換，一旦Cyclin D1表達異常上調，組織細胞生長會無序增加。研究認為LSCC可能與pRb抑癌功效降低和/或Cyclin D1表達上調密切相關[5]。但目前有關pRb/Cyclin D1在LSCC發生中表達程度和相關性的報道較少。本實驗采用Western-blotting技術檢測LSCC、聲帶息肉(Vocal Cord Polyp, VCP)和癌前病變(Laryngeal Precarcinoma Lesions，LPL)組織的pRb和Cyclin D1表達水平并分析其相關性，探討pRb和Cyclin D1對LSCC發病機制的作用及對臨床診斷和治療的意義。

1資料與方法

1.1臨床標本和分組

2014-05—2015-05在枝江市人民醫院耳鼻咽喉科住院，經電子喉鏡、頸部MRI增強掃描、頸部及腹部超聲和喉部病變組織活檢等常規檢查后，確定手術治療患者36例，分別接受喉部手術，摘除病灶組織迅速用生理鹽水沖洗，去除血跡，旋即用無菌手術刀切取病變組織的中心部位后平分為二，一部分置于10%中性福爾馬林溶液中固定，常規石蠟包埋，HE染色，由三位經驗豐富的病理科醫師進行組織形態學鏡檢；另一部分立即置于-80℃液氮凍存，待檢pRb和Cyclin D1表達水平。組織病理學明確診斷36例樣本中LSCC 12例(LSCC組，男9例，女3例，年齡42-79歲，平均60.50±12.30歲；且既往無喉部手術史；手術前沒有接受任何放療、化療或免疫治療；不伴不典型增生；無并發其它癌癥及急慢性疾病史)，聲帶息肉12例(息肉組，男7例，女5例，年齡40-65歲，平均52.50±9.60歲)，癌前病變12例(癌前組，分別為喉角化病、喉黏膜白斑病、疣狀增生等，男9例，女3例，年齡57-77歲，平均67.00±10.20歲)。三組性別、年齡比較差異無統計學意義(P均>0.05)。本實驗經枝江市人民醫院倫理委員會批準，并遵循患者知情同意原則。

1.2主要實驗儀器和試劑

1.2.1儀器：高速臺式低溫離心機(MMLT-XIR，Thermo公司，美國)；-80℃超低溫冰箱(MDF-U53V，Sanyo公司，日本)；酶標儀(Synergy HF，Bio-tek公司，美國)；垂直電泳儀(PowerPacTM HC, Bio-Rad公司，美國)；Western Blot轉移電泳儀(XCell SureLock， Invitrogen公司，美國)；雙通道熒光掃描儀(ODY-2182，Li-Cor公司，美國)；紫外凝膠成像系統(VL，Vilber公司，法國)；Teflon梳子，NC膜和Wortman濾紙等。

1.2.2試劑：兔抗人pRb和Cyclin D1單克隆抗體均購自美國Epitomics公司(批號：20150605)；二奎啉甲酸(BCA)蛋白定量試劑盒購自美國Thermo公司(貨號：8817-423)；溴酚藍、蛋白質電泳Marker、牛血清白蛋白(BSA)、兔抗人單克隆抗GAPDH抗體(批號：20151423)、考馬斯亮藍G-250、丙烯酰胺、TBST緩沖液、脫脂奶粉均購自美國sigma公司；T-Per組織蛋白裂解液、蛋白酶抑制劑等購自美國Pierec或Roche公司。

1.3Western-blotting技術檢測組織pRb/Cyclin D1蛋白表達

從-80℃冰箱中取出標本，加入10g組織樣本到冰凌包繞的預存有1ml組織蛋白裂解液和20μl蛋白酶抑制劑的EP管中(10mg/100μl組織裂解液)，用勻漿器勻漿，12 000rpm和4℃條件下離心5min后，置于4℃條件下保存10min待用。應用BCA蛋白定量試劑盒檢測蛋白質濃度。蛋白表達檢測用聚丙烯酰胺凝膠電泳法(SDS-PAGE)，通過灌膠、上樣(Marker和待測提取液各50μl)、電泳，獲得帶有蛋白條帶的分離膠。在分離膠上標記方向，用一張NC膜和兩張Wortman濾紙按濾紙-凝膠-NC膜-濾紙平鋪于支撐墊上轉膜2h，完成后將NC膜置于TBST緩沖液浸洗5min，再放于含5%脫脂奶粉的膜封閉液中振蕩2h。分別加入適量兔抗人pRb和Cyclin D1單克隆抗體(各為1∶200)以及兔抗人單克隆抗GAPDH抗體(內參照)，振蕩后溫育2h，加入辣根過氧化物酶標記的羊抗兔二抗(1∶5 000)

溫育1h， DAB顯色，用紫外凝膠成像系統掃描和攝像，將目的蛋白電泳條帶與GAPDH條帶在同一張膜上比較后擬合繪圖和定量分析，兩者積分光密度(OD)比值分別代表pRb和Cyclin D1表達水平。

1.4統計學處理

2結果

息肉組、癌前組和LSCC組pRb蛋白和Cyclin D1蛋白差異均有統計學意義(P<0.01)。pRb蛋白表達依次降低，LSCC組最低；而Cyclin D1蛋白表達依次升高，LSCC組最高。兩兩比較，癌前組pRb積分OD比值明顯低于息肉組(t=8.31,P<0.01)，LSCC組更低于癌前組(t=7.17,P<0.01)。癌前組Cyclin D1蛋白表達高于息肉組(t=5.19,P<0.01)，LSCC組高于癌前組(t=3.28,P<0.01)。結果見圖1和表1。相關性分析顯示，各組pRb與Cyclin D1的蛋白表達均呈顯著負相關(r分別為-0.94、-0.83和-0.92，P均<0.01)。

圖1　不同病變組織pRb和Cyclin D1的表達

組 別pRbCyclinD1息肉組1.95±0.380.28±0.17癌前組1.09±0.291)0.86±0.331)LSCC組0.32±0.092)1.78±0.632)F值36.7862.51

注：與息肉組比較，1)P<0.01；與癌前組比較，2)P<0.01

3討論

喉癌中，以發生于喉腔黏膜上皮組織的LSCC最常見，好發于50-70歲人群，男性多于女性[6]。LSCC是一種細胞周期紊亂性疾病，分子生物學機制可能與原癌基因激活及腫瘤抑制基因失活、轉錄失調等基因表達異常密切相關[2]。在細胞形態發生明顯變化之前，分子水平的癌基因與抑癌基因就可能已出現了異常變化，通過檢測癌組織中相關蛋白表達，可為喉癌的早期發現和分子診斷提供量化依據[7]。

pRb是抑癌基因Rb的表達產物，在視網膜母細胞瘤、乳腺癌、鼻咽癌、大腸癌等多種腫瘤組織中表達異常，其缺失和突變均影響細胞增殖調控[8]。Cyclin D1是周期素蛋白家族關鍵蛋白，在細胞周期中發揮正性調節作用，當機體細胞中Cyclin D1拷貝數增加、染色體重排及基因多態性改變時，正常組織細胞新舊更替失去控制，可導致惡性腫瘤發生[9]。本文采用Western-blotting檢測發現，LSCC患者pRb表達顯著減少，Cyclin D1表達明顯增加，異常程度均較息肉組織和癌前病變組織嚴重。表明LSCC發生后，處于細胞周期G1/S調控中心部位的pRb活性嚴重降低，而控制細胞增殖G1中期的關鍵蛋白Cyclin D1異常增加，最終造成腫瘤的發生和發展。pRb和Cyclin D1兩種分子標志物的異常變化，可以為喉癌的早期發現和治療提供靶標，將喉組織惡變趨勢消除在萌芽狀態[10,11]。

pRb和Cyclin D1表達水平檢測為闡述LSCC發生機制提供了分子學證據，本文相關性分析顯示，無論息肉組、癌前組和LSCC組，其pRb蛋白表達與Cyclin D1蛋白表達均呈顯著負相關，提示LSCC的發生與pRb和Cyclin D1的此消彼漲關系密切。pRb抑癌功能失活和Cyclin D1調控細胞增殖加速，決定了喉部組織惡變的程度[12]，其作用機制可能為當患者喉部的宿主細胞遭受外來分裂刺激因素的激活和放大后，處于細胞分裂增殖G1/S調控點(G1/S Checkpoint)中心部位的pRb進行性減少，激活細胞周期控制蛋白Cyclin D1過表達，并與細胞周期依賴性激酶結合，磷酸化pRb，導致與pRb結合的轉錄因子E2F與pRb分離；而游離的E2F可充分發揮轉錄因子作用，激活有關基因，使喉組織細胞跨過G1/S checkpoint，由G1期向S期演進，引起細胞增殖。而且低磷酸化的pRb還可能刺激Cyclin D1轉錄、合成和活化，導致pRb更進一步磷酸化，從而在G1晚期形成一反饋環節，調節Cyclin D1進一步過度表達，阻斷干擾素產生，增加外源DNA的整合及突變，抵抗細胞凋亡，使細胞永生化，最終造成喉組織細胞增殖失控而促進LSCC的發生[13]。

綜上所述，LSCC 的發生和發展與細胞周期調控中心的pRb降低和Cylin D1增加密切相關，呈現顯著負相關性。提示臨床疑診LSCC時，檢測標本組織中pRb和Cyclin D1表達水平，有利于佐證臨床診斷和分析發病原因及機制。而且癌前喉組織pRb和Cyclin D1表達的檢測或可為LSCC的早期預防和治療提供分子靶標。

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曾漢榮(1963—)，男，漢族，副主任醫師，主要從事耳鼻咽喉-頭頸外科疾病的臨床防治

參考文獻

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The Abnormal Expressions of pRb and Cyclin D1 in Laryngeal Squamous Cell Carcinoma Patients

ZENG Han-rong1, YANG Hong-nu1, LI Wen-xing2, TU Xing3, LI Zhi-hua2, KONG We-jia3

1Department of Otolaryngology, The People’s Hospital of Zhijiang City, Zhijiang 443200,China;2Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Renmin Hospital of Wuhan University, Wuhan 430060,China;3School of Life Science of Tongji Hospital,Huazhong University of Science and Technology, Wuhan 430022,China

【Abstract】Objective: To investigate the abnormal expressions of retinoblastoma protein (pRb) and cell cycle protein D1 (Cyclin D1) in laryngeal squamous cell carcinoma (LSCC) patients.Method: All pathological specimens, which were respectively included 12 cases of LSCC group and vocal cord polyp (VCP group) as well as laryngeal precarcinoma lesions (LPL group) were selected from patients, who were accepted radical surgery treatments because of different diseases of laryngeal tissures. The expression of pRb and Cyclin D1 were detected by Western-blotting methods. Moreover, correlational difference between different proteins were analyzed and compared by used statistical software in the mentioned above three groups.Results: Compared with VCP group, the expression of pRb was markedly decreased (P<0.01), and the expression of Cyclin D1 was notably increased in LPL group (P<0.01). Compared with LPL group, however, the quantitative levels of pRb was furtherly decreased (P<0.01), moreover, the quantitative levels of Cyclin D1 was significenlly increased in LSCC group (P<0.01). The expression of pRb had significant negative correlation with that of Cyclin D1 with -0.94 in VCP group and -0.83 in LPL group as well -0.92 in LSCC group (P of all <0.001).Conclusion: The occurrence and development of patients with LSCC might have significant relationship with that pRb was severely decreased and Cyclin D1 was significantly increased.

【Key words】Laryngeal squamous cell carcinoma; Retinoblastoma protein; Cell cycle protein D1

[中圖分類號]R739.65

[文獻標識碼]A

[文章編號]1005-1740(2016)02-0066-04

第一作者簡介：本文

[作者單位]1湖北省枝江市人民醫院耳鼻咽喉科， 枝江 443200；2武漢大學人民醫院耳鼻咽喉-頭頸外科，武漢 430060；3華中科技大學同濟生命科學學院，武漢 430022

本文2016-02-02收到，2016-03-11修回