淫羊藿苷對SGC-7901細胞內(nèi)CaSR及Survivin、Runx3基因表達的影響

李　姝　許曉義　孫　健　董　琦　陳　徹

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淫羊藿苷對SGC-7901細胞內(nèi)CaSR及Survivin、Runx3基因表達的影響

李姝1，2許曉義2孫健2董琦2陳徹1

【摘要】目的 觀察淫羊藿苷（ICA）聯(lián)合鈣敏感受體（CaSR）活性改變對胃癌SGC-7901細胞增殖的影響，及其細胞內(nèi)CaSR及Survivin、Runx3基因表達的影響。方法 MTT法與Hoechst染色法測定細胞的增殖與凋亡情況。Western blot和RT-PCR技術(shù)檢測CaSR、Survivin及Runx3蛋白和mRNA的表達情況。結(jié)果 ICA聯(lián)合Calindol（CaSR激動劑）抑制SGC-7901細胞增殖，細胞生長抑制率與對照組相比，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0．05），呈時間依賴性；并誘導(dǎo)細胞凋亡。ICA聯(lián)合Calindol促進SGC-7901細胞內(nèi)CaSR和Runx3蛋白和mRNA表達上調(diào)，Survivin蛋白和mRNA表達下調(diào)。結(jié)論 ICA聯(lián)合Calindol能夠抑制胃癌SGC-7901細胞增殖并誘導(dǎo)凋亡，其作用與下調(diào)Survivin和上調(diào)Runx3的表達有關(guān)。

【關(guān)鍵詞】淫羊藿苷；胃癌SGC-7901細胞；CaSR；Runx3；Survivin

作者單位：1 甘肅中醫(yī)藥大學(xué)醫(yī)學(xué)技術(shù)學(xué)院生化教研室，甘肅 蘭州730000；2 牡丹江醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院機能學(xué)教研室，黑龍江 牡丹江157011

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，根據(jù)2012年［1］中國腫瘤登記年報，胃癌在我國發(fā)病率高居第二位，死亡率也高居第三位。中醫(yī)認為胃癌［2］的形成與內(nèi)外因關(guān)系密切，正氣不足貫穿于胃癌發(fā)病的始終。淫羊藿苷（icariin，ICA）是淫羊藿的主要有效提取成分，現(xiàn)代藥理學(xué)研究證明ICA具有扶正培本，活血化瘀，增強免疫力且不良反應(yīng)小、對染色體無改變和不產(chǎn)生基因突變的特點，對多種腫瘤細胞例如肺癌、肝癌、淋巴瘤［3］等具有增殖抑制的作用。

1　材料與方法

1.1細胞

SGC-7901細胞，購自中國科學(xué)院上海細胞庫。

1.2實驗藥品及試劑

ICA（成都瑞芬思生物科技有限公司）；改良型RPMI1640培養(yǎng)基（Hyclone公司）；Calindol、Calhex231（美國Sigma）；全蛋白提取試劑盒（沈陽萬類生物科技有限公司）。

1.3實驗方法

1.3.1細胞培養(yǎng) 人胃癌細胞株SGC-7901用含10％胎牛血清的改良RPMI1640培養(yǎng)液（含1％雙抗），置于37℃，5％CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，實驗所用細胞均處于對數(shù)生長期。

1.3.2MTT法檢測細胞增殖 實驗設(shè)對照組、實驗組、陽性對照組，以1×105/ml的懸液接種于96孔板中。每組設(shè)3個復(fù)孔，重復(fù)3次，每孔加入5 mg/ml的MTT溶液20 ul，4 h后，棄上清，加入DMSO溶液150 ul，振蕩10 min，用酶標(biāo)儀于490 nm波長下測定每孔A值，取平均值，按細胞生長抑制率=（1-實驗組A平均值∕對照組A平均值）×100％計算。

1.3.3Hoechst染色檢測細胞凋亡 將清潔蓋玻片置于6孔板內(nèi)，種板，孵育24 h，分組加藥后繼續(xù)培養(yǎng)48 h。加入4％多聚甲醛0.5 ml，固定20 min。加入1 ml Hoechst33342染色液，室溫染色15～30 min。吸除染色液，PBS洗滌2次，每次3 min。

1.3.4Western blot技術(shù)檢測CaSR、Survivin及Runx3 收集各組細胞，提取細胞總蛋白。BCA法測蛋白濃度后，取40μg蛋白上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，封閉，一抗anti-CaSR（1﹕1000）、anti- Survivin（1﹕500）、anti- Runx3（1﹕500）4℃過夜，洗膜后，常溫二抗孵育1 h，ECL發(fā)光試劑盒顯色后曝光、顯影、定影、掃描。

1.3.5RT-PCR技術(shù)檢測CaSR、Survivin及Runx3 按高純總RNA快速提取試劑盒（中國 BioTeke）提取總RNA，反轉(zhuǎn)錄，實時熒光定量分析，使用MX-3000P軟件（美國Stratagen公司）分析PCR過程各檢測樣本的CT（Threshold cycle）值。

1.4統(tǒng)計學(xué)分析 采用SPSS 17.0統(tǒng)計學(xué)軟件進行分析處理，實驗結(jié)果以（均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差）（±s）表示，單因素方差分析（One-Way，ANOVA）進行組間差異的比較，以P＜0.05表示差異具有統(tǒng)計學(xué)意義。

2　結(jié)果

2.1ICA聯(lián)合CaSR活性改變對SGC-7901細胞增殖的影響

ICA聯(lián)合Calindol作用于SGC-7901細胞后，聯(lián)合用藥組的細胞生長抑制率均高于二者單獨作用效果，具有時間依賴效應(yīng)（見表1）。

2.2ICA聯(lián)合Calindol對SGC-7901細胞凋亡的影響

Hoechst染色結(jié)果顯示，與對照組相比，ICA聯(lián)合Calindol作用于SGC-7901細胞后，凋亡細胞的細胞核變小，呈致密濃染，或呈碎塊狀致密濃染的顆粒狀熒光（圖1）。

圖1　ICA聯(lián)合Calindol對SGC-7901細胞凋亡的影響A．對照組；B．ICA（200 mg/L）；C．ICA（200 mg/L）+ Calindol（10 μg/L）；D．卡鉑（1 mg/ml）

2.3Western blot和RT-PCR檢測CaSR、Survivin、Runx3蛋白和mRNA表達

結(jié)果顯示，ICA促進Runx3蛋白和mRNA表達上調(diào)，抑制Survivin蛋白和mRNA的表達，與對照組相比P＜0.05。ICA與Calindol聯(lián)合后CaSR、Runx3蛋白和mRNA表達上調(diào)，Survivin蛋白和mRNA表達下調(diào)的水平均大于二者單獨作用效果，差異具有統(tǒng)計學(xué)意義，P＜0.05（見圖2）。

圖2　ICA聯(lián)合CaSR活性改變對SGC-7901細胞內(nèi)CaSR、Survivin、Runx3蛋白及mRNA表達的影響注：1．對照組；2．ICA（200 mg/L）；3．Calindol（10ug/L）；4．Calhex231（10ug/L）；5．ICA（200 mg/L）+ Calindol（10ug/L）；6．ICA（200 mg/L）+ Calhex231（10ug/L）；7．陽性對照組：卡鉑（1mg/mL）

3　討論

近年來，淫羊藿苷的抗腫瘤作用越來越受到醫(yī)藥研究者的重視。研究內(nèi)容所涉及的抗腫瘤途徑不盡相同，對于具體癌癥細胞的作用機制也不盡相同。Ca2+是細胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)中的第二信使，研究發(fā)現(xiàn)Ca2+可以通過CaSR發(fā)揮“第一信使”的作用，調(diào)節(jié)細胞的增殖、分化、凋亡和分泌［4］。細胞凋亡是生理性細胞死亡的過程，有助于正常細胞和組織的生長和維護。細胞凋亡通路的失調(diào)會導(dǎo)致一些疾病如惡性腫瘤的發(fā)生，所以直接調(diào)控凋亡的Survivin蛋白在腫瘤發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮越來越重要的作用［5-8］。抑癌基因Runx3是轉(zhuǎn)錄因子Runt結(jié)構(gòu)域家族的一員，并在細胞凋亡、血管再生、上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化、細胞遷移和侵襲的調(diào)控上起關(guān)鍵作用。目前尚未有關(guān)于ICA聯(lián)合CaSR活性改變對胃癌細胞增殖抑制和誘導(dǎo)凋亡的作用與Survivin、Runx3基因的表達變化情況的相關(guān)報道。本實驗采用Western blot 和RT-PCR技術(shù)檢測ICA聯(lián)合Calindol對SGC-7901細胞內(nèi)CaSR、Survivin、Runx3表達的影響，結(jié)果顯示ICA促進CaSR表達上調(diào)，但沒有統(tǒng)計學(xué)意義；促進Runx3蛋白表達上調(diào)和Survivin蛋白表達下調(diào)，與對照組相比有顯著性差異（P＜0.05）。

表1　ICA聯(lián)合CaSR活性改變對SGC-7901細胞的抑制率（n=3，±s）

表1　ICA聯(lián)合CaSR活性改變對SGC-7901細胞的抑制率（n=3，±s）

注：1．對照組；2．ICA（200 mg/L）；3．Calindol（10ug/L）；4．Calhex231（10ug/L）；5．ICA（200 mg/L）+ Calindol（10ug/L）；6．ICA（200 mg/L）+ Calhex231（10ug/L）；7．陽性對照組：卡鉑（1mg/mL）；與對照組比較，*P＜0.05

24h　48h　72h A值　抑制率（％）　A值　抑制率（％）　A值　抑制率（％）1　1.136±0.040　—　1.286±0.037　—　1.431±0.064　—2　0.669±0.002　41.094±2.082*　0.572±0.123　55.495±2.167*　0.482±0.024　66.255±2.615* 3　0.869±0.043　24.594±6.345*　0.772±0.025　39.905±3.110*　0.671±0.019　53.014±3.224* 4　1.171±0.087　-3.024±4.439　1.477±0.061　-15.003±7.635*　1.722±0.278　-19.948±13.985* 5　0.535±0.023　52.832±3.493*　0.490±0.029　61.850±3.155*　0.395±0.015　72.323±2.044* 6　0.872±0.036　21.949±2.563*　0.816±0.013　36.462±2.411*　0.754±0.013　47.200±2.900* 7　0.436±0.015　61.551±1.997*　0.235±0.006　81.732±0.860*　0.204±0.002　85.713±0.752*分組

綜上所述，ICA聯(lián)合Calindol對SGC-7901細胞具有抑制增殖和誘導(dǎo)凋亡的作用，這與其促進Runx3基因表達上調(diào)和Survivin基因表達下調(diào)有關(guān)。然而，ICA作為淫羊藿的主要有效單體成分，其抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用可否應(yīng)用于臨床胃癌患者的中藥復(fù)方制劑，還有待于進一步研究。

參考文獻

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The Effect of Icariin on the Expression of CaSR， Survivion， Runx Gene in SGC-7901 Cells o

LI Shu1，2 XU Xiaoyi2 SUN Jian2 DONG Qi2 CHEN Che1， 1 Department of Biochemistry， College of medical technology， Gansu University of traditional Chinese medicine， Lanzhou Gansu， 730000， China， 2 Department of function， College of Basic Medicine， Mudanjiang Medical University， Mudanjiang Heilongjiang， 157011， China

［Abstract］Objective To observe the effect of activity changes of icariin combined with calcium sensing receptor （CaSR） on the proliferation and the expression of CaSR， Survivin and Runx3 genes in SGC-7901 cell. Methods The method of MTT and Hoechst staining d were used to detect the proliferation and apoptosis of cells. The technology of western blot and RT-PCR were used to detect the expression of CaSR， Survivin，Runx3 protein and mRNA. Results ICA combined with Calindol （CaSR agonist） inhibits the proliferation of SGC-7901 cells， which showed a time dependent manner and induced cell apoptosis， compared with the control group， the difference was statistically significant （P＞0.05）. ICA combined with Calindol promotes the expression of CaSR， Runx3 protein and mRNA in SGC-7901 cells. Conclusion ICA combined with Calindol can inhibit the proliferation and induce apoptosis of SGC-7901 cells， its effect is related to the expression of Survivin down-regulation and Runx3 up-regulation.

［Key words］ICA， Gastric cancer SGC-7901 cells， CaSR， Runx3， Survivin

【中圖分類號】R735

【文獻標(biāo)識碼】A

【文章編號】1674-9308（2016）11-0227-03

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．11．155

項目基金：黑龍江省教育廳科學(xué)技術(shù)研究項目（項目編號：12531749）

通訊作者：陳徹，E-mail：chen72123@163．com