人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及向汗腺樣細(xì)胞分化研究

聶廣辰

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人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生物學(xué)特性及向汗腺樣細(xì)胞分化研究

聶廣辰

【摘要】目的 體外分離、純化及培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞（UC-MSCs），觀察其生物學(xué)特性并研究其定向分化成汗腺樣細(xì)胞的能力。方法 將剔除動(dòng)靜脈的新鮮人臍帶組織切成小段，剝離血管后酶解，釋放細(xì)胞貼壁生長(zhǎng)，倒置顯微鏡觀察細(xì)胞形態(tài)，繪制第3代生長(zhǎng)曲線；流式細(xì)胞儀測(cè)定細(xì)胞表面標(biāo)記（CD105、CD73、CD90、CD34、CD45、CD14 和HLA-DR）；定向誘導(dǎo)分化后PT-PCR檢測(cè)汗腺發(fā)育基因EDA及EDAR表達(dá)。結(jié)果 原代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞呈現(xiàn)典型的成纖維樣形態(tài)。體外誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)證實(shí)，該細(xì)胞陽(yáng)性表達(dá)汗腺特異基因。結(jié)論 人臍帶MSCs體外可以分化成汗腺樣細(xì)胞，為利用人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞修復(fù)汗腺損傷提供了可靠地理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。

【關(guān)鍵詞】臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞；汗腺細(xì)胞；免疫學(xué)

作者單位：哈爾濱市第五醫(yī)院骨一科，黑龍江 哈爾濱 150070

目前臨床上對(duì)燒傷患者汗腺功能損傷的恢復(fù)是一個(gè)十分困難的問(wèn)題，同時(shí)也是一個(gè)急需解決的現(xiàn)實(shí)問(wèn)題。目前有較多報(bào)道研究發(fā)現(xiàn)間充質(zhì)干細(xì)胞可參與人體汗腺和皮膚損傷細(xì)胞的修復(fù)和再生。但目前有關(guān)間充質(zhì)干細(xì)胞的研究大多來(lái)自骨髓方面的研究，隨著人年齡的增長(zhǎng)，骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞數(shù)量和分化能力也會(huì)因此而下降。獲取人體骨髓會(huì)給患者造成一定創(chuàng)傷，且易產(chǎn)生并發(fā)癥等，因此而給患者生命健康造成嚴(yán)重影響［1-2］。所以，尋找一種新的間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)源顯得十分關(guān)鍵，相比骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞來(lái)說(shuō)，UCMSCs的發(fā)育階段要更早，并且其所生長(zhǎng)的環(huán)境也更為單純，同時(shí)還具有強(qiáng)大分泌因子能力和超低免疫原型等，有利于體外培養(yǎng)［3-4］。

1　材料與方法

1.1材料、主要試劑與儀器

臍帶、皮膚組織、rh-EGF、三碘甲狀腺原氨酸、半琥珀酰氫化可的松、胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉（Sigma公司）。

1.2UC-MSCs分離與培養(yǎng)

將所收集的臍帶放置于無(wú)菌環(huán)境中進(jìn)行培養(yǎng)，然后放入培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)處理，并應(yīng)用胰酶消化法來(lái)分離出UC-MSCs。試驗(yàn)過(guò)程中需使用剪刀將臍帶組織剪切成3～5 cm片段。然后使用0.25％胰酶處理，之后再將臍帶組織搗碎，最后收集搗碎組織放入25 cm2培養(yǎng)瓶中進(jìn)行培養(yǎng)。

1.3細(xì)胞生長(zhǎng)曲線繪制

選取第3代培養(yǎng)細(xì)胞懸浮液進(jìn)行接種，并培養(yǎng)8 d。然后再采用MTT法來(lái)檢測(cè)細(xì)胞增殖率，并繪制生長(zhǎng)曲線。

1.4汗腺樣細(xì)胞細(xì)胞誘導(dǎo)

采用汗腺培養(yǎng)基（DMEM-F12+10％FBS+10 ng/100 ml rh-EGF+2 nMol/ml 三碘甲狀腺原氨酸+0.4 μg/ml 胰島素-轉(zhuǎn)鐵蛋白-亞硒酸鈉）培養(yǎng)原代汗腺細(xì)胞達(dá)70％～80％回合度后，置47℃環(huán)境熱休克40 min，室溫冷卻2 h，再將汗腺細(xì)胞置于二氧化碳培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)［5］。收集熱休克汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基上清，過(guò)濾，按體積分?jǐn)?shù)10％加入汗腺細(xì)胞培養(yǎng)基中構(gòu)成汗腺誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基。待第3代UC-MSCs生長(zhǎng)達(dá)到指數(shù)期是，用汗腺分化誘導(dǎo)液進(jìn)行培養(yǎng)，2～3 d換液一次。UC-MSCs用普通培養(yǎng)基培養(yǎng)相同時(shí)間作為陰性對(duì)照組［6］。

1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

2　結(jié)果

2.1形態(tài)觀察

采用倒置顯微鏡觀察培養(yǎng)7 d后原代細(xì)胞，可見(jiàn)細(xì)胞集落、貼壁細(xì)胞呈典型成纖維狀；詳細(xì)如圖1。每3 d換1次培養(yǎng)液，10 d后移除組織塊。

圖1　人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察（40x）A：原代培養(yǎng)7 d后；B：第三代細(xì)胞生長(zhǎng)達(dá)到100％匯合

2.2人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

接種第三代細(xì)胞后，其中＜72 h為潛伏期；對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期為72～96 h，當(dāng)?shù)降?～8 d時(shí)則為生長(zhǎng)平臺(tái)期，見(jiàn)圖2。此次研究中，進(jìn)行傳代培養(yǎng)，結(jié)果顯示15代內(nèi)無(wú)明顯細(xì)胞衰老和增殖速度減慢情況發(fā)生。

圖2　第3代人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞生長(zhǎng)曲線

2.3免疫表型分析

第3代細(xì)胞CD105、CD73及CD90等MSCs標(biāo)志物的表達(dá)結(jié)果為陽(yáng)性。造血系細(xì)胞的表面抗原CD34、CD45及CD14等為陰性。

2.4人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞體外誘導(dǎo)汗腺樣細(xì)胞潛能

RT-PCR結(jié)果顯示，經(jīng)過(guò)3周的分化誘導(dǎo)，分化后的UCMSCs表達(dá)汗腺發(fā)育相關(guān)基因EDA和EDAR，而未誘導(dǎo)細(xì)胞不表達(dá)EDA和EDAR，如圖3。

圖3　RT-PCR檢測(cè)UC-MSCs向汗腺樣細(xì)胞誘導(dǎo)前后汗腺發(fā)育基因表達(dá)

4　討論

皮膚組織工程最終目的是要構(gòu)建出一種皮膚替代物，能迅速實(shí)現(xiàn)完整皮膚功能的重建：具備所有皮膚附屬器（毛囊、皮脂腺、汗腺等），分層良好，并實(shí)現(xiàn)血管化及神經(jīng)功能迅速重建，盡可能完美愈合。目前還沒(méi)有一種理想的組織工程皮膚能滿足臨床嚴(yán)重皮膚缺損患者的需求，其重要原因之一是無(wú)理想的種子細(xì)胞及其何時(shí)來(lái)源。成體干細(xì)胞尤其是成體干細(xì)胞中的骨髓來(lái)源干細(xì)胞在皮膚組織工程應(yīng)用中取得了巨大進(jìn)步，但是其獲取數(shù)量有限，取材較困難，供體有限，隨年齡增長(zhǎng)增殖分化能力下降，且有病毒污染可能，因而尋找其他來(lái)源的干細(xì)胞成為近年來(lái)的研究熱點(diǎn)。

人UC-MSCs的來(lái)源十分廣泛，并且培養(yǎng)相對(duì)簡(jiǎn)單，難以被污染，提取過(guò)程不會(huì)給患者造成創(chuàng)傷，因此值得研究。目前大規(guī)模地應(yīng)用人UC-MSCs于臨床中尚需進(jìn)行多方位的論證和研究，從而可保障患者生命健康。從本次研究結(jié)果可知，UC-MSCs生長(zhǎng)特性、體外定向分化則為汗腺樣細(xì)胞能力。本次研究中應(yīng)用酶消化輔助法可有效縮短細(xì)胞貼壁時(shí)間，提高細(xì)胞提取率，同時(shí)還可減少雜細(xì)胞，這樣則可提高原代細(xì)胞純度，提高試驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性［7］。利用流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，貼壁細(xì)胞高表達(dá)間充質(zhì)干細(xì)胞的表面抗原CD73 和CD90及CD105，但其并不表達(dá)造血細(xì)胞表面抗原CD34、CD14 及CD45，人臍帶中分離的細(xì)胞符合間充質(zhì)干細(xì)胞表達(dá)特征［8］。

外胚層發(fā)育不良蛋白EDA是調(diào)控汗腺發(fā)育的功能基因之一［9］，EDA主要分為兩個(gè)亞型：EDA-A1和EDA-A2；EDAR是EDA-A1基因受體，在汗腺組織發(fā)育工程中同樣起著重要的調(diào)控作用。因此我們將EDA和EDAR作為鑒定汗腺組織的基因標(biāo)記物。在本實(shí)驗(yàn)中，對(duì)體外誘導(dǎo)分化的UC-MSCs進(jìn)行RT-PCR檢測(cè)，發(fā)現(xiàn)誘導(dǎo)后汗腺樣UC-MSCs表達(dá)汗腺相關(guān)基因EDA和EDAR，而未誘導(dǎo)的對(duì)照組則不表達(dá)這兩種基因［10］。這證明了UC-MSCs分化為汗腺細(xì)胞的能力。

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Biological Characteristics of Human Umbilical Cord Mesenchymal Stem Cells and Their Differentiation into Sweat Gland-like Cells

NIE Guangchen， The First Section of Orthopedics， Harbin Fifth Hospital，Harbin Heilongjiang， 150070， China

［Abstract］Objective To isolate， purify and culture human umbilical cord mesenchymal stem cells （UC-MSCs） in vitro， and to observe the biological characteristics of human umbilical cord mesenchymal stem cells （MSCs） and to study their ability to differentiate into sweat gland like cells. Methods Cut into small pieces of arteriovenous excluding fresh human umbilical cord tissue， artery dissection after enzymatic hydrolysis， releasing adherent cell growth， inverted microscope observation cell morphology，draw a third generation growth curve， flow cytometry determination of cell surface markers（CD105， CD73， CD90， CD45， CD34， CD14 and HLADR）， directional differentiation of RT-PCR sweat glands development gene of EDA and EDAR expression.Results After inoculation of the third generation of cells， which ＞72 h incubation period， logarithmic growth phase was 72 ～ 96 h， when to 7 ～ 8 d was for growth plateau. In this study，the results showed that there was no obvious cell aging and the proliferation rate of the 15 generations. Conclusion Human umbilical cord MSCs can differentiate into sweat gland like cells in vitro， which provides a reliable theoretical basis and experimental basis for the use of human umbilical cord mesenchymal stem cells in the repair of sweat gland injury.

［Key words］Umbilical cord mesenchymal stem cells， Sweat gland cells，Immunology

【中圖分類(lèi)號(hào)】R329

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

【文章編號(hào)】1674-9308（2016）11-0225-03

doi：10．3969/j．issn．1674-9308．2016．11．154