高效液相色譜法測定人血清中茶堿濃度

孔幸珊，曾彩芳，楊佳彬

（廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，廣東廣州　511447）

?

高效液相色譜法測定人血清中茶堿濃度

孔幸珊，曾彩芳，楊佳彬

（廣州醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院，廣東廣州511447）

摘要：目的建立測定人體內茶堿血藥濃度的高效液相色譜（HPLC）法。方法采用10%三氟乙胺沉淀處理血清樣品，色譜柱為Inertsil ODS-SP柱（250 mm×4.6 mm，5 μm），流動相為甲醇-水（25∶75），流速1.0 mL/min，紫外檢測波長274 nm，柱溫25℃。結果茶堿血藥濃度在2.55～40.72 μg/mL范圍內與峰面積線性關系良好，回歸方程為Y=45 417.2 X-4 580.0，r=0.999 8（n=6）。日內和日間精密度的RSD分別不超過4.88%和6.06%，定量限為0.2 μg/mL。結論該法快速、準確，適用于臨床茶堿血藥濃度監(jiān)測。

關鍵詞：茶堿；高效液相色譜法；血藥濃度監(jiān)測

茶堿是黃嘌呤類藥物，作為嘌呤受體阻滯劑能抑制磷酸二酯酶活性，松弛支氣管平滑肌［1］。其臨床主要用于支氣管哮喘、阻塞性肺氣腫等肺部疾病［2］，療效確切，價格低廉，且不易出現耐受。但茶堿的治療窗比較窄，臨床多種常用藥物均能降低茶堿的清除率［3-5］，容易出現因血藥濃度過高導致的藥品不良反應。監(jiān)測茶堿血藥濃度是保證臨床安全、合理使用茶堿的重要手段。為此，筆者建立了可快速測定茶堿血藥濃度的高效液相色譜（HPLC）法。現報道如下。

1　儀器與試藥

1.1儀器

LC-20A型高效液相色譜儀（日本島津公司，包括SIL-20A自動進樣器，LC-20AT溶液輸送泵，SPD-20A UV-VIS Detector，工作站，柱溫箱）。Eppendorf 5424R型臺式高速低溫離心機；AUW120D型天平（十萬分之一，日本島津公司）。

1.2試藥

茶堿對照品（批號為100121-201104，中國食品藥品檢定研究院）；甲醇（色譜純，MERCK公司）；試驗用水為去離子水，經0.45 μm濾膜過濾后使用；三氟乙酸，氫氧化鈉均為化學純。健康人空白血漿由本院檢驗科提供，樣品血漿由呼吸科和心血管內科提供。

2　方法與結果

2.1色譜條件

色譜柱：Inertsil ODS-SP柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：甲醇-水（25∶75）；流速：1.0 mL/min；紫外檢測波長：274 nm；柱溫：25℃；進樣量：20 μL。

2.2溶液配制

將茶堿對照品于105℃下干燥2 h后，精密稱取10.18 mg，置10 mL容量瓶中，加甲醇水［甲醇-水（25∶75）］充分溶解，稀釋至刻度，得標準貯備液（質量濃度為1.018 g/L），于4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

2.3血清樣品處理

取空白血清380 μL，加入20 μL標準茶堿溶液，渦旋混合10 s，加10%三氟乙酸150 μL，渦旋2 min，12 000 r/min離心12 min，取上清液400 mL，加入30 μL 1 mol/L NaOH渦旋混合10 s，12 000 r/min離心6 min，取上清液400 μL，進樣分析。

2.4方法學考察

專屬性試驗：按擬訂色譜條件分別對對照品溶液、空白血清和茶堿標準品血清進行分析，色譜圖見圖1。可見，茶堿峰未受血清雜質峰干擾，茶堿的保留時間是5.8min。

圖1　血藥濃度測定高效液相色譜圖

標準曲線與檢測限考察：取標準茶堿溶液，制備50.9，101.8，203.6，407.2，610.8，814.4 μg/mL系列質量濃度溶液。取血清380 μL，分別加入20 μL茶堿對照品溶液，得血清藥物濃度分別為2.55，5.09，10.18，20.36，30.54，40.72 μg/mL標準血清樣品，按2.3項下方法處理，進樣分析，記錄色譜圖，以茶堿峰面積為縱坐標（Y），茶堿質量濃度為橫坐標（X）建立標準曲線，得線性回歸方程Y=45 417.2 X-4 580.0，r=0.999 8（n=6）。結果表明，茶堿質量濃度在2.55～40.72 μg/mL間與峰面積線性關系良好。以信噪比（S/N）≥3計算最低檢測限為0.06 μg/mL，以S/N≥10計算定量限為0.2 μg/mL。

回收率與精密度試驗：配制低、中、高3種質量濃度（分別為2.55，10.18，30.54 μg/mL）的含藥血清樣品，按2.3項下方法操作。日內每種質量濃度平行配制5份，依法測定，以測得質量濃度值與真實值的比表示方法回收率，計算RSD，作為日內精密度；連續(xù)測定3 d，計算RSD作為日間精密度。結果見表1和表2。

表1　茶堿的方法回收率試驗結果（n=5）

表2　茶堿的日內精密度和日間精密度試驗結果（n=5）

2.5臨床應用

監(jiān)測呼吸科及心血管內科服用茶堿緩釋片患者的血藥濃度，抽血時間為患者連續(xù)服用茶堿緩釋片5次（當藥物濃度達到穩(wěn)態(tài)時），于第6次服藥前30 min（谷濃度）抽血。患者茶堿血藥濃度為8.17～10.19 μg/mL。其中心血管內科患者同時服用調血脂藥瑞舒伐他汀、拜阿司匹林等，呼吸科患者服用阿奇霉素、左氧氟沙星、氨溴索、異丙托溴銨等，所有患者的茶堿血藥濃度均未受其他藥物影響。結果見圖2，表明本法可用于臨床藥物濃度檢測。

圖2　臨床樣品高效液相色譜圖

3　討論

以往報道采用高效液相色譜法測定茶堿血藥濃度的文獻［6-8］較多，試驗中發(fā)現，隨著流動相中甲醇比例的增大，茶堿的出峰時間縮短。水的極性比甲醇大，茶堿是黃嘌呤結構衍生物，結構中雖然含N—H，但氮原子的孤對電子與相鄰的C=N形成p-π共軛，降低了N—H的極性，因此增加流動相中甲醇的比例，體系的極性降低，根據相似相容原理，茶堿的保留時間就相對減少，故出峰時間減短。但出峰時間過短，容易受血漿中的蛋白干擾，而出峰時間過長，監(jiān)測耗時，浪費溶劑，增加成本；相比甲醇-磷酸鹽體系作為流動相［9］，以甲醇-水為流動相更簡單經濟，更能延長色譜柱的使用壽命。故選擇甲醇-水（25∶75）作為流動相，茶堿出峰時間為5.8 min，比較合適。

血漿樣品處理曾考察經典提取法和蛋白沉淀法，其中經典提取法用乙酸乙酯提取，40℃真空干燥箱干燥，操作復雜，耗時較長，但回收率較高；蛋白沉淀法分別選用甲醇、乙腈和10%三氟乙酸作為沉淀劑，沉淀效果10%三氟乙酸>乙腈>甲醇。故選擇10%三氟乙酸作為蛋白沉淀劑處理樣品，操作簡單，快速。雖然蛋白沉淀法的提取回收率不及提取法，但茶堿血藥濃度監(jiān)測需要的最低檢測濃度較高，10%三氟乙酸蛋白沉淀法的最低定量限達0.2 μg/mL，可較好地滿足試驗要求。

茶堿有效血藥濃度的治療范圍是5～20 μg/mL，當藥物濃度達到15～20 μg/mL時，個別人群即可發(fā)生輕微的毒性反應，其在人體內的藥物濃度受年齡［10］、生理病理因素［11］和其他藥物的相互作用［1，3］影響，因此建立一個簡便的茶堿藥物濃度監(jiān)測的方法輔助臨床安全用藥十分有意義。本法簡單、快速、靈敏、專項性強，分離完全，不受臨床用藥干擾，可廣泛用于臨床監(jiān)測茶堿血藥濃度。

參考文獻：

［1］陳新謙，金有豫，湯光.新編藥物學［M］.第17版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2011：446.

［2］陳灝珠，林果為，王吉耀.實用內科學（下冊）［M］.第14版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2014：1 698.

［3］魏喜芹，繆月琴.左西替利嗪對大鼠氨茶堿血藥濃度的影響［J］.中國醫(yī)院藥學雜志，2014，34（18）：1 579-1 581.

［4］陳世才，劉憲軍.氨茶堿和常用抗菌藥物的相互作用［J］.臨床藥物治療雜志，2008，6（2）：24-28.

［5］呂向群.喹諾酮類與茶堿類藥物相互作用的研究進展［J］.中國藥業(yè)，2012，21（6）：88-89.

［6］馬金秋，王娜，王莉，等.RP-HPLC法測定人血清中茶堿與多索茶堿的濃度［J］.中國藥房，2010，21（18）：1 665-1 667.

［7］唐富山，佟婉紅，牟希恒.反相高效液相色譜法同時測定血清中多索茶堿和茶堿的濃度［J］.甘肅醫(yī)藥，2011，30（9）：517-519.

［8］張峻，姚勤，周瓊，等.RP-HPLC法同時測定人血漿中茶堿和多索茶堿的濃度［J］.中國藥房，2010，21（42）：3 974-3 975.

［9］孔秋芹，楊水新.茶堿類藥物的血藥濃度監(jiān)測方法與應用［J］.福建醫(yī)藥雜志，2005，27（6）：149-151.

［10］羅美娟，劉石帶，黃靚，等.1 350例茶堿血藥濃度分析［J］.海峽藥學，2014，26（6）：150-152.

［11］譚湘萍.茶堿血藥濃度的臨床監(jiān)測與分析［J］.中國醫(yī)院用藥評價與分析，2009，9（9）：679-680.

Determination of Serum Theophylline Concentration by HPLC

Kong Xingshan，Zeng Caifang，Yang Jiabin
（The Fourth Affiliated Hospital of Guangzhou Medical University，Guangzhou，Guangdong，China 511447）

Abstract：Objective To establish an HPLC method to determine the concentration of theophylline in human plasma.Methods The serum sample was performed the precipitation treatment by 10%trifluoroacetic acid，the chromatographic column was the Inertsil ODS-SP column（250 mm×4.6 mm，5 μm），the mobile phase was consisted of methanol-water（25∶75）.The UV detection wavelength was at 274 nm with a flow rate of 1.0 mL/min and the column temperature of 25℃.Results The concentration of theophylline in the range of 2.55-40.72 μg/mL showed good linearity.The regression equation of plasma theophylline concentration and peak area was Y=（45 417.2）X-4 580.0，r=0.999 8（n=6）.The intra-day and inter-day RSD were less than 4.88%and 6.06%，and the limit quantitation was 0.2 μg/mL.Conclusion The established method is fast，accurate and suitable for therapeutic dug monitoring （TDM）of theophylline in clinical.

Key words：theophylline；HPLC；TDM

中圖分類號：R969.1；R974+.3

文獻標識碼：A

文章編號：1006-4931（2016）07-0030-03

作者簡介：孔幸珊（1987-），女，廣東廣州人，碩士研究生，藥師，主要從事臨床藥學工作，（電話）020-39195632（電子信箱）kongxingshan@126.com；楊佳彬（1981-），男，廣東廣州人，大學本科，主管藥師，主要從事臨床藥學工作，本文通訊作者，（電話）020-39195632（電子信箱）nfyyyjb@126.com。

收稿日期：（2015-09-27）