siRNA靶向抑制MACC1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

西安市中心醫(yī)院(西安710003)　農(nóng)晰婷　楊　光 　張　昱

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siRNA靶向抑制MACC1對(duì)結(jié)直腸癌細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響

西安市中心醫(yī)院(西安710003)農(nóng)晰婷楊光△張昱▽

摘要目的：采用小干擾RNA(siRNA)靶向抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中MACC1的表達(dá)，觀察其對(duì)腫瘤細(xì)胞增殖和侵襲能力的影響。方法： Real time-PCR檢測(cè)MACC1在結(jié)直腸癌組織和細(xì)胞株中的表達(dá)水平；利用Lipofectmin2000將MACC1特異性siRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)入結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo和SW620；利用Real time-PCR和Western blot法明確細(xì)胞中MACC1在mRNA和蛋白水平上的表達(dá)變化；通過(guò)CCK-8法檢測(cè)腫瘤細(xì)胞增殖水平的變化，并利用Transwell系統(tǒng)檢測(cè)腫瘤細(xì)胞體外遷移和侵襲能力的變化。結(jié)果：MACC1在結(jié)直腸癌中表達(dá)較正常腸黏膜顯著升高；與陰性對(duì)照比較，MACC1 siRNA能夠特異性抑制LoVo和SW620細(xì)胞中MACC1基因的表達(dá)，并引起腫瘤細(xì)胞的增殖水平降低，遷移和侵襲能力減弱。結(jié)論： 利用siRNA特異性抑制MACC1的表達(dá)，可以降低結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖水平和侵襲能力。MACC1是抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的重要潛在靶點(diǎn)。

主題詞結(jié)直腸腫瘤/病理生理學(xué)基因/代謝腫瘤轉(zhuǎn)移@MACC1

腫瘤轉(zhuǎn)移播散及其引起的并發(fā)癥是致患者死亡的最主要原因。目前針對(duì)轉(zhuǎn)移性結(jié)直腸癌的治療是以?shī)W沙利鉑、5-FU等為基礎(chǔ)的聯(lián)合化療為主，輔以貝伐單抗等生物抗體治療。即便如此，其中位生存期仍不足2年[1]。因此，深入探索結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移的分子機(jī)制，尋找新的治療靶點(diǎn)和藥物，是未來(lái)研究的重要方向。

癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因(Metastasis-associated in colon cancer-1，MACC1)是一個(gè)新近被鑒定的結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移相關(guān)基因。體內(nèi)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，MACC1通過(guò)激活與腫瘤轉(zhuǎn)移關(guān)系密切的HGF/Met信號(hào)途徑，從而促進(jìn)結(jié)直腸癌的生長(zhǎng)、侵襲和轉(zhuǎn)移[2]。除結(jié)直腸癌外，有研究也發(fā)現(xiàn)：MACC1的表達(dá)水平在胃癌、肺癌和肝癌中與腫瘤的侵襲轉(zhuǎn)移程度密切相關(guān)，可以作為獨(dú)立的腫瘤轉(zhuǎn)移預(yù)測(cè)指標(biāo)[3～5]。這些研究均提示MACC1是一個(gè)治療腫瘤轉(zhuǎn)移的潛在靶點(diǎn)。本研究利用siRNA技術(shù)靶向抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中MACC1的表達(dá)，觀察腫瘤細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的變化，以期為結(jié)直腸癌基因治療提供新靶點(diǎn)和新方法。

材料與方法

1細(xì)胞株和試劑結(jié)直腸癌細(xì)胞株LoVo、SW620、SW480、HT29和HCT116購(gòu)于中科院上海細(xì)胞庫(kù)。MACC1特異性siRNA由上海吉瑪生物合成。MACC1多克隆兔抗購(gòu)于美國(guó)Abcam公司。其他試劑材料：Lipofectamine2000、Trizol reagent、cDNA first chain kit(美國(guó)Invitrogen公司)；SYBR green qPCR kit(大連寶生物公司)；CCK-8細(xì)胞增殖kit(杭州碧云天公司)；Transwell細(xì)胞培養(yǎng)系統(tǒng)(美國(guó)Corning公司)；ECM基質(zhì)膠(美國(guó)BD公司)。

2細(xì)胞培養(yǎng)和轉(zhuǎn)染5種結(jié)直腸癌細(xì)胞株均培養(yǎng)于含10%FBS的RPMI-1640培養(yǎng)基中。根據(jù)Lipofectamine2000說(shuō)明書(shū)進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。細(xì)胞分為陰性對(duì)照組(NC siRNA)和干擾組(MACC1siRNA)。轉(zhuǎn)染后24h或48h收集細(xì)胞分別用于提取總RNA和蛋白用于下一步實(shí)驗(yàn)。

3熒光定量PCR檢測(cè)MACC1mRNA表達(dá)水平收集細(xì)胞，Trizol法提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄(cDNA first chain kit)合成cDNA后，運(yùn)用SYBR green 染料法定量PCR檢測(cè)MACC1mRNA水平，內(nèi)參使用GAPDH。引物序列：MACC1forward 5’-GGTCAGGAAGAATTGCACAAAG-3’，reverse 5’-GGTCCTGGCATT-CTGTAATATTGC-3’；GAPDH forward 5’-AGACAGCCGCATCTTCTTGT-3’，reverse 5’-TTGAATTTGCCATGAGTGGA-3’；MACC1siRNA sense 5’-GCCCGU-UGUUGGAAAUCAUTT-3’，antisense 5’-AUGAUUUCCAACAACGGGCTT-3’。

4Western blot檢測(cè)MACC1表達(dá)水平收集細(xì)胞，RIPA法提取總蛋白。SDS-PAGE垂直電泳每孔上樣40μg，轉(zhuǎn)移至PVDF膜后，兔抗人MACC1多克隆抗體(1∶1000)孵育4℃過(guò)夜，HRP標(biāo)記羊抗兔二抗(1∶5000)孵育1h，ECL法發(fā)光。內(nèi)參使用β-actin。

5CCK-8法檢測(cè)細(xì)胞增殖水平變化細(xì)胞消化制成懸液后種于96孔板中，每孔0.5×104個(gè)。培養(yǎng)貼壁24h后進(jìn)行siRNA轉(zhuǎn)染。轉(zhuǎn)染后繼續(xù)培養(yǎng)24h、48h和96h。培養(yǎng)終止前2h每孔加入10μl CCK-8溶液，孵育2h，利用酶標(biāo)儀讀取OD450nm波長(zhǎng)下的吸光度值。

6Transwell細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)細(xì)胞轉(zhuǎn)染24h后，用胰酶消化并重懸于無(wú)血清的RPMI-1640培養(yǎng)基中制成細(xì)胞懸液。遷移實(shí)驗(yàn)中，Transwell系統(tǒng)上室加入2×105個(gè)細(xì)胞，下室加入500μl含10%FBS的培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)48h。培養(yǎng)終止后，用棉簽輕擦去碳酸酯膜上表面的細(xì)胞，位于下表面的遷移細(xì)胞用4%多聚甲醛固定，1%結(jié)晶紫染色，風(fēng)干。倒置顯微鏡下拍照，100×下任意選取6個(gè)視野計(jì)算細(xì)胞數(shù)。侵襲實(shí)驗(yàn)中，在上室預(yù)鋪ECM基質(zhì)膠(1∶7稀釋)，待凝固后加入3×105個(gè)細(xì)胞。其余步驟與遷移實(shí)驗(yàn)一致。

結(jié)果

1 MACC1在結(jié)直腸癌中表達(dá)顯著升高在納入研究的18對(duì)結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中，有13例癌組織中MACC1mRNA表達(dá)水平顯著高于其對(duì)應(yīng)的癌旁正常黏膜(圖1A)(P< 0.05)。進(jìn)一步檢測(cè)了5種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中MACC1mRNA的表達(dá)，發(fā)現(xiàn)5種細(xì)胞中MACC1mRNA表達(dá)均顯著高于作為對(duì)照的正常腸黏膜(圖1B)(P <0.05)。

2siRNA特異性抑制MACC1的表達(dá)首先利用Western blot方法檢測(cè)5種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中MACC1mRNA和蛋白的表達(dá)水平，結(jié)果顯示5種細(xì)胞中均有MACC1不同程度表達(dá)，而轉(zhuǎn)移性較強(qiáng)的LoVo和SW620細(xì)胞中，MACC1的表達(dá)水平相對(duì)更高(見(jiàn)圖2A)。因此我們選擇LoVo和SW620細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)的siRNA干擾和細(xì)胞功能學(xué)實(shí)驗(yàn)。圖2B可見(jiàn)轉(zhuǎn)染siRNA后的LoVo和SW620細(xì)胞較轉(zhuǎn)染前，其MACC1的表達(dá)水平明顯受到抑制。

3下調(diào)MACC1的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲通過(guò)siRNA干擾下調(diào)MACC1表達(dá)后，利用CCK-8法檢測(cè)了LoVo和SW620細(xì)胞增殖能力的變化。如圖3A所示：轉(zhuǎn)染48h后，轉(zhuǎn)染組LoVo細(xì)胞的增殖水平與陰性對(duì)照相比顯著下降(P<0.05)，而SW620細(xì)胞則在轉(zhuǎn)染72h后，其增殖水平相比陰性對(duì)照有顯著下降(P<0.05)。在Transwell實(shí)驗(yàn)中，MACC1表達(dá)下調(diào)后，LoVo和SW620細(xì)胞與陰性對(duì)照組相比，其運(yùn)動(dòng)遷移(LoVo: 85.34±9.66 vs 140.20±13.82; SW620: 105.00±9.38 vs79.33±4.76)和侵襲通過(guò)基質(zhì)膠的能力(LoVo: 52.81±11.47 vs115.36±10.94; SW620: 90.33±10.26 vs 64.50±6.28)也明顯減弱(見(jiàn)圖3B和3C)(P <0.05)。

圖1MACC1在結(jié)直腸癌中表達(dá)異常升高(A：18對(duì)結(jié)直腸癌及對(duì)應(yīng)癌旁組織中MACC1mRNA的表達(dá)；B： 5種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中MACC1mRNA的表達(dá))

圖2siRNA靶向抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞中MACC1蛋白表達(dá)(A：MACC1在5種結(jié)直腸癌細(xì)胞株中的表達(dá)情況；B：siRNA抑制LoVo和SW620細(xì)胞中MACC1蛋白表達(dá))

討論

近年來(lái)，我國(guó)結(jié)直腸癌發(fā)病率呈明顯上升趨勢(shì)，發(fā)病率和死亡率居所有惡性腫瘤第四位。隨著診療水平和治療手段的提高，一些早期發(fā)生的結(jié)直腸癌能夠被治愈或取得不錯(cuò)的治療效果。但對(duì)于更多進(jìn)展期的，尤其是發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移的腫瘤，仍缺乏有效的治療手段。目前，抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的策略正從傳統(tǒng)的聯(lián)合化療轉(zhuǎn)變?yōu)榛熃Y(jié)合基因生物治療。多種針對(duì)促轉(zhuǎn)移基因的生物抗體藥物，如西妥昔單抗(抗EGFR)、貝伐單抗(抗VEGF)等相繼進(jìn)入臨床。在分子機(jī)制研究方面，許多腫瘤轉(zhuǎn)移相關(guān)基因被鑒定并報(bào)道，為腫瘤治療提供了理論依據(jù)和新的治療靶點(diǎn)。

圖3下調(diào)MACC1的表達(dá)抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲能力(A: 下調(diào)MACC1抑制癌細(xì)胞增殖；B: 下調(diào)MACC1抑制LoVo細(xì)胞遷移和侵襲；C: 下調(diào)MACC1抑制SW620細(xì)胞遷移和侵襲)

HGF/Met 信號(hào)途徑是一個(gè)明確的促腫瘤生長(zhǎng)轉(zhuǎn)移的信號(hào)途徑。它的激活可以引起細(xì)胞發(fā)生多種惡性轉(zhuǎn)化，如上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)、腫瘤血管生成、細(xì)胞運(yùn)動(dòng)性增加、侵襲力增強(qiáng)，最終引起腫瘤轉(zhuǎn)移[1]。Stein等[2]利用裸鼠模型研究發(fā)現(xiàn)，MACC1通過(guò)與HGF/Met途徑形成正反饋關(guān)系參與到結(jié)直腸癌的轉(zhuǎn)移過(guò)程中，促進(jìn)腫瘤的原位生長(zhǎng)以及肝轉(zhuǎn)移。具體機(jī)制為，HGF與腫瘤細(xì)胞膜上表達(dá)的Met結(jié)合可以促進(jìn)MACC1轉(zhuǎn)位進(jìn)入胞核，轉(zhuǎn)錄激活Met表達(dá)，進(jìn)一步刺激HGF/Met途徑的活性。MACC1的表達(dá)水平與胃癌、肺癌和肝癌的轉(zhuǎn)移侵潤(rùn)程度呈顯著正相關(guān)性，提示MACC1——HGF/Met正反饋機(jī)制可能普遍存在于固體腫瘤轉(zhuǎn)移過(guò)程中。近期，Pichorner等[6]運(yùn)用非侵入性的影像技術(shù)觀察發(fā)現(xiàn)，在使用MACC1shRNA處理后，裸鼠結(jié)直腸癌模型中的原位瘤生長(zhǎng)明顯減慢，轉(zhuǎn)移灶形成減少，提示MACC1是抗腫瘤轉(zhuǎn)移治療的重要潛在靶點(diǎn)。

本研究利用siRNA靶向抑制MACC1的表達(dá)，通過(guò)細(xì)胞學(xué)實(shí)驗(yàn)證實(shí)下調(diào)MACC1可以抑制結(jié)直腸癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，補(bǔ)充和鞏固了已有研究成果，為將來(lái)以MACC1作為靶點(diǎn)的抗結(jié)直腸癌轉(zhuǎn)移治療提供了一定理論依據(jù)。

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(收稿：2015-01-15)

【中圖分類(lèi)號(hào)】R735.3

【文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼】A

doi：10.3969/j.issn.1000-7377.2016.01.003

△ 陜西省人民醫(yī)院心內(nèi)二科

▽云南省人民醫(yī)院消化內(nèi)科