脂聯素在兔主動脈動脈粥樣硬化斑塊內的表達研究*

西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科(西安710061)　王芝榮　舒　娟

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脂聯素在兔主動脈動脈粥樣硬化斑塊內的表達研究*

西安交通大學醫學院第一附屬醫院心內科(西安710061)王芝榮舒娟

摘要目的：探討脂聯素在兔動脈粥樣硬化斑塊內的分布特點。方法：選擇動脈粥樣硬化新西蘭兔12只，對照組12只，處死每組動物后取出主動脈，觀察脂聯素在各組動脈粥樣硬化斑塊中的表達。結果：動脈粥樣硬化兔血管壁脂聯素蛋白表達均顯著低于正常對照組(P<0.05)。結論：脂聯素蛋白在動脈粥樣硬化兔血管壁表達顯著減低，脂聯素蛋白表達水平上調可抑制動脈粥樣硬化的發展。

主題詞脈動硬化/診斷細胞因子類/代謝膽固醇/代謝胰島素抗體 動物，實驗兔@脂聯素

動脈粥樣硬化(Atherosclerosis，AS)是一種大、中型動脈血管的慢性非特異性炎癥病變,也是目前公認為人群死亡的主要原因。脂聯素(Adiponectin，APN)是一個與胰島素抵抗關系最緊密的特異性細胞因子，由脂肪組織所表達和分泌，其功能為抑制脂質的聚集、使巨噬細胞對脂質吞噬減少、進而抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉化[1]，從而延緩動脈粥樣硬化的發生、發展[2]。本研究擬探討兔動脈粥樣硬化斑塊內ANP表達的特點，為人類動脈粥樣硬化的預防和治療提供研究基礎。

材料與方法

1實驗動物及藥品選擇動脈粥樣硬化新西蘭兔12只，對照組12只，均為雄性，1月齡，體重1.4～1.7kg，購自西安交通大學實驗動物中心。脂聯素抗體(Anti-Adiponectin)購自北京博奧森生物技術有限公司。

2標本取材及留取用3%戊巴比妥鈉(30mg/kg)全身麻醉實驗動物后空氣栓塞處死動物，取出各組動物主動脈，去除血管外組織，生理鹽水沖洗后用中性甲醛液固定。

3免疫組化特異性染色免疫組織化學染色法觀察主動脈血管內皮脂聯素表達水平。結果判定：血管壁脂聯素蛋白的表達陽性結果為血管壁染成棕黃色，顯微鏡顯影系統采集圖像，選擇血管壁隨機取3個視野(×400)，計算機自動測量并計算陽性信號積分光密度(A值)。

4 Western blot檢測主動脈脂聯素蛋白的表達提取總蛋白，用BCA試劑盒測定蛋白總濃度及變性。以50ug/孔總蛋白上樣，行SDS-PAGE凝膠電泳，分離蛋白后轉膜，加入一抗(1∶250鼠抗兔ANP單克隆抗體或者1∶1000鼠抗兔β-actin)4℃孵育過夜。TBST浸洗后加入二抗(羊抗鼠IgG，1∶1000稀釋)4℃孵育過夜。應用凝膠掃描成像系統中進行掃描分析，以β-actin作為內參。

5統計學處理采用SPSS17.0統計軟件處理所有數據，對滿足正態分布的計量資料兩組間比較采用t檢驗，用Pearson法行相關分析，以P<0.05為有顯著性差異，P<0.01為有極顯著性差異。

結果

1兩組間AS斑塊面積比較動脈粥樣硬化組AS斑塊面積與動脈內膜面積比值為(38.35±4.33)%，顯著高于正常對照組(0．00±0.00)%，兩組有顯著性差異(P<0.05)。

2兩組間動脈壁脂聯素特異性染色陽性面積比較見圖1。動脈粥樣硬化組血管壁脂聯素蛋白表達為0.465±0.045，顯著低于正常對照組(0.643±0.073)，兩組有極顯著性差異(P<0.01)。

A 正常對照組　　　　　　 　　　　　　　　　 B動脈粥樣硬化組

3 Western blot檢測兩組間主動脈脂聯素蛋白的比較見圖2。經Western blot檢測發現動脈粥樣硬化組血管壁脂聯素蛋白表達為0.765±0.085，顯著低于正常對照組(1.610±0.173)，兩組有顯著性差異(P<0.01)。

圖2　兩組間 Western blot檢測主動脈脂聯素蛋白的比較

4 脂聯素蛋白與動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內膜面積比值的相關性分析為了進一步了解脂聯素蛋白與動脈粥樣硬化的關系，行脂聯素蛋白與動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內膜面積比值的相關分析，通過分析發現脂聯素蛋白與動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內膜面積比值呈顯著負相關(r=-0.573；P<0.001)。

討論

ANP是由脂肪細胞分泌的一種特異性蛋白質，具有保護血管內皮細胞、抗動脈粥樣硬化、調節胰島素抵抗的作用[3]。此外APN還可使內皮細胞減少對白介素-8和組織因子等炎癥因子的表達[4]，降低內皮細胞和白細胞相互作用[5]，抑制巨噬細胞向泡沫細胞轉化，減少對氧化的低密度脂蛋白攝取，降低脂質在泡沫細胞內堆積[6]，從而保護血管結構，抑制AS的發生、發展。以上研究清楚地描述了脂聯素延緩動脈粥樣硬化的發生、發展的機制，并闡明脂聯素與AS密切相關。

本研究結果顯示：動脈粥樣硬化組主動脈血管壁脂聯素蛋白表達顯著低于正常對照組，且脂聯素蛋白與動脈粥樣硬化斑塊面積與動脈內膜面積比值呈顯著負相關。即主動脈血管壁脂聯素蛋白表達陽性面積水平上調可在一定程度上延緩動脈粥樣硬化的發生發展。隨著對AS發病機制分子水平研究的不斷深入，有ANP在抗AS中的作用將成為新的研究熱點。

參考文獻

[1] Ouchi N, Kihara S, Arita Y, et al. Adipocyte-derived plasma protein, adiponectin, suppresses lipid accumulation and classA scavenger receptor expression in human monocyte-derived macrophages [J]. Circulation，2001，103(8)：1057-1063.

[2] Zietz B, Herfarth H, Paul G, et al. Adiponectin represents an independent cardiovascular risk factor predicting serum HDL-cholesterol levels in type 2 diabetes [J]. FEBS Lelt, 2003, 545(2～3):103-104.

[3] Vaiopoulos AG，Marinou K，Christodoulides C，et al．The role of adiponectin in human vascular physiology[J]．Int J Cardiol, 2012,155(2) : 188-193.

[4] Chen YJ, Zhang LQ, Wang GP,et al. Adiponectin inhibits tissue factor expression and enhances tissue factor pathway inhibitor expression inhuman endothelial cells[J]. Thromb Haemost,2008,100(2): 291-300.

[5] Mahadev K, Wu X, Donnelly S, et al. Adiponectin inhibits vascular endothelial growth factor-induced migration of human coronary artery endo-thelial cells [J]. Cardiovasc Res, 2008,78(2) : 376-384.

[6] Tian L, Luo N, Klein RL，et al. Adiponectin reduces lipid accumulation in macrophage foam cells [J]. Atherosclerosis,2009,202(1)：152-161.

(收稿：2015-08-20)

The expression of adiponectin of aortic atherosclerosis plaque area in rabbits Department of Cardiology, The First Affiliated Hospital of Medicol College，

Xi’an Jiaotong University(Xi’an710061) Wang ZhirongShu Juan

ABSTRACTObjective：To investigate the expression of adiponectin of aortic atherosclerosis plaque area in rabbits. Methods：12 atherosclerotic rabbits and 12 normal rabbits were sacrificed. Aortic atherosclerotic lesion area, intimal thickness and intimal / media thickness ratio were measured. Expression of adiponectin of aortic atherosclerosis plaque area in rabbits were detected. Results： Protein expression of adiponectin in normal rabbits is greater than that in atherosclerotic rabbits (P<0.01).Conclusion：Accelerated levels of adiponectin can slow down the speed of atherosclerosis.

KEY WORDSArteriosclerosis/diagnosisCytokines/metabolismCholesterol/ metabolismInsulin antibodiesAnimals,laboratoryRabbits@ Adiponectin

【中圖分類號】R743.1

【文獻標識碼】A

doi:10.3969/j.issn.1000-7377.2016.01.002

*陜西省科學技術研究發展計劃項目(2004K17-G22)