類風濕性關節炎患者循環microRNAs生物標志物的篩選及鑒定

彭武建，王紅蕾，黃建溶，戴勇（.深圳市第三人民醫院 腎內科，廣東 深圳 58000；.南方醫科大學附屬第三醫院 腎內科，廣東廣州 50000；.暨南大學第二臨床醫學院 深圳市人民醫院 臨床醫學研究中心，廣東 深圳 5800）

?

類風濕性關節炎患者循環microRNAs生物標志物的篩選及鑒定

彭武建1，王紅蕾2，黃建溶1，戴勇3
（1.深圳市第三人民醫院 腎內科，廣東 深圳 518000；2.南方醫科大學附屬第三醫院 腎內科，廣東廣州 510000；3.暨南大學第二臨床醫學院 深圳市人民醫院 臨床醫學研究中心，廣東 深圳 518020）

［摘 要］目的：分析類風濕性關節炎（RA）患者血漿中差異表達的microRNAs（miRNAs）。方法：采用miRNA芯片檢測、篩選RA患者與正常人血漿中表達有顯著變化的miRNAs，并采用RT-qPCR技術對芯片數據進行驗證。數據處理采用GeneSpring GX軟件，t檢驗和方差分析用于統計學分析。結果：RA患者與正常人間存在差異的循環miRNAs共有40個，其中18個上調，22個下調。根據循環miRNAs在芯片中表達差異的倍數和潛在的生物學價值，選取4個miRNAs進行RT-qPCR驗證，候選的miRNAs與正常對照間差異有統計學意義（P＜0.05），證實芯片結果可靠性。結論：RA患者體內具有差異表達的循環miRNAs，這些循環miRNAs可作為一種潛在的RA候選生物標志物。

［關鍵詞］類風濕性關節炎；微小RNA；芯片；生物標志物

類風濕性關節炎（rheumatoid arthritis，RA）是一種以外周滑膜關節慢性炎性病變、關節軟骨和骨質進行性不可逆性破壞為特征的全身性自身免疫性疾病［1］。目前RA的診斷采用1987年美國風濕病學會（ACR）修訂的診斷分類標準［2］，符合此標準的患者常已出現嚴重的關節破壞，不利于RA的早期診斷。因此，尋找RA特異性的疾病診斷生物標志物尤為重要。

微小RNA（microRNAs，miRNAs）是一類長約18～25 nt的內源性非編碼RNA，在轉錄后水平調控基因的表達［3］。miRNAs參與免疫功能調節過程及自身免疫性疾病的發生與進展［4-6］。在循環系統中同樣可以檢測到miRNAs的存在，且血清/血漿中miRNAs在不同的疾病狀態下存在著差異表達，可作為一類具有潛在價值的用于臨床的生物標志物［7-8］。因此，本研究應用miRNA基因芯片檢測RA患者與正常對照組的循環miRNAs表達譜，分析2組間差異表達miRNAs，進行生物信息學分析及實時熒光定量PCR（RT-qPCR）驗證，為進一步研究RA的發病機制奠定基礎。

1　對象和方法

1.1對象 收集深圳市人民醫院風濕免疫科35例RA患者，其中男9例，女26例，年齡18～70歲，平均（44.9±11.5）歲。RA診斷符合1987年美國風濕協會修訂的RA診斷標準［2］。RA組患者在接受大劑量糖皮質激素、細胞毒性藥物及免疫抑制劑治療前完成標本采集。正常對照組選取30例排除了自身免疫系統疾病、肝腎功能正常的健康體檢者，其中男10例，女20例，年齡26～52歲，平均（42.9±8.7）歲。各組間性別、年齡差異無統計學意義，具可比性。先每組取10例，進行芯片初篩，余下病例作為RT-qPCR驗證。研究計劃經醫院倫理委員會批準，受試對象均簽署知情同意書。

1.2標本采集及總RNA的抽提和質檢 EDTA抗凝管采集新鮮血液，在4 h內以2 000×g離心10 min，吸取上層血漿于凍存管中，-80 ℃凍存。按mirVana PARIS試劑盒（Ambion）說明書從600 μL的血漿中抽提總RNA，紫外分光光度計測量A260/A280值，測定濃度。

1.3混合樣本池法檢測循環miRNAs 按照等量混合的原則，每組10個樣品各取10 ng混合到成100 ng，進行芯片檢測。

1.4樣品標記及雜交 本實驗所用Agilent Human miRNAs microarray Rel 12.0（上海伯豪生物有限公司）涵蓋886個人類相關miRNAs以及89個人類病毒相關miRNAs。100 ng總RNA經Cy3熒光基團標記及干燥處理后與芯片雜交20 h（55 ℃，20 r/min）。然后進行芯片洗滌、掃描。

1.5芯片圖像采集和數據分析 Agilent Feature Extraction（FE）software version 9.5.3軟件提取數據。應用GeneSpring GX軟件，以Fold change ≥2，P≤0.05標準，篩選RA患者與正常人血漿中差異表達miRNAs。Fold Change指的是將2組數據均一化后，用信號值直接計算其差異的倍數。應用TargetScan、microRNA.org、PITA數據庫，進行靶基因預測及GO和KEGG分析。

1.6RT-qPCR驗證 應用RT-qPCR對4個顯著性差異表達的miRNAs進行檢測。引物序列如下：miR-16：5’-ACACTCCAGCTGGGTAGCAGCACGTAAATATT-3’；miR-155： 5’-ACACTCCAGCTGGGTTAATGCTAATCGTGATA-3’；miR-223：5’-ACACTCCAGCTGGGTGTCAGTTTGTCAAATAC-3’；miR-451：5’-ACACTCCAGCTGGGAAACCGTTACCATTACTG-3’；Cel-lin4：5’-ACACTCCAGCTGGGTCCCTGAGACCTCA AGTG-3’。反應體系：5.0 μL cDNA（1∶20），10 μL 2x SYBR Green PCR Master Mix（TOYOBO），1.0 μL的引物補充RNase-free水至20 μL，以Cel-lin4為內參，利用RT-qPCR儀（ABI PRISM 7 500 Sequence Detection System，ABI USA）進行PCR反應，反應條件：預反應95 ℃ 5 min；95 ℃ 15 s，65 ℃ 15 s，72 ℃ 32 s，共40個循環。采用2-ΔΔct法計算相對表達值［9］。

1.7統計學處理方法 采用SPSS19.0軟件進行統計學處理，計量資料以±s表示，2組間比較使用t檢驗，以P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1循環miRNAs在RA患者血漿中的表達 采用miRNA芯片實驗，發現在RA患者和正常人血漿中存在著差異表達的miRNAs共有40個，其中18個上調，22個下調（見表1）。基于目前的研究，根據芯片結果和miRNAs潛在的價值選取4個miRNAs進行第二階段的驗證。

表1　RA患者與正常對照間血漿差異表達的miRNAs

2.2RT-qPCR驗證差異表達的miRNAs 采用RT-qPCR檢測miR-16、miR-451、miR-223、miR-155在RA患者與正常人血漿中的表達情況（見圖1），其中miR-16、 miR-451和miR-223在RA患者血漿中表達量明顯高于正常對照組（P＜0.05），而miR-155卻低于正常對照組（P＜0.05）。

圖1 循環miRNAs RT-qPCR驗證結果

2.3生物信息學結果 為了研究miRNAs的生物學功能，用Target Scan Human Custom（http∶//www. targetsan.org）分別對差異表達的miRNAs進行靶基因預測。利用KEGG數據庫對靶基因進行Pathway分析，以P＜0.01，至少2個基因存在于該信號傳導通路為限制條件，尋找相關信號通路，主要有：癌癥相關通路、調節肌動蛋白細胞骨架通路、泛素介導的蛋白降解通路以及趨化因子信號通路等（見表2）［10］。

3　討論

本實驗利用芯片檢測結合生物信息學方法，篩選了RA患者與正常人血漿中差異表達的40個miRNAs。通過對這些差異表達的循環miRNAs及可能靶基因進行功能分類，進一步推測其對RA的診斷和治療潛在的意義。發現在RA患者和正常人血漿中存在著差異表達的miRNAs共有40個，其中18個上調，22個下調。本實驗中大部分miRNAs表達與文獻［11］報道相符，但有部分miRNAs，如miRNA-146a在本研究中未見表達差異。這可能與芯片敏感性可能是試驗誤差有關，故需要進行RT-qPCR驗證芯片結果。根據芯片中miRNAs的表達倍數和miRNAs潛在表達意義，本實驗選擇了4個miRNAs進行驗證，其中miR-16、miR-451和miR-223在RA患者血漿中的相對表達上調，而miR-155表達下調。候選循環miRNAs驗證結果與芯片結果一致，證明了芯片結果的可靠性。

表2　KEGG信號通路表

目前發現miR-451在腫瘤患者中可調節細胞的增殖、浸潤和凋亡。研究表明，miR-451抑制通過p38 MAPK抑制中性粒細胞的趨化性，是RA的潛在治療靶點［12］。然而該研究中RA患者的中性粒細胞中miR-451低表達，而本研究顯示循環miR-451高表達不符合，原因尚有待進一步明確。miR-16家族在特定環境中可通過調控cyclin D及CDK等細胞周期相關基因的表達誘導細胞周期G1期阻滯［13］。敲除內源性的miR-16可顯著延長TNF-α mRNA的半衰期［14］。miR-16與RA成纖維細胞增殖及滑膜細胞炎癥反應密切相關［11］。miR-155被證實參與炎癥、免疫和腫瘤的發生、發展多種生理病理過程。miR-155抑制間質金屬蛋白酶MMP-1、MMP-1的生成，緩解關節組織破壞。miR-155在RA患者滑液中表達水平升高，通過減少Toll受體配體MMP-3和細胞因子表達來達到控制慢性炎癥、減少滑膜組織損害的作用［15-16］。此外，miR-155參與免疫反應，在調節造血干細胞的活化、增殖和分化，淋巴細胞發育，T、B細胞免疫應答過程中發揮作用［17］。miR-155的異常表達可導致淋巴細胞功能紊亂，發生自身免疫性疾病。RA患者滑膜組織中的miR-155高表達，它在滑膜組織中控制破骨細胞的分化，提示參與滑膜炎及骨質破壞［18］。miR-223也在造血干細胞的分化、粒細胞的分化激活中起著至關重要的作用［19］。有研究表明，miR-223參與腎移植后急性排斥反應［20］。本研究顯示，RA患者中，其血漿循環miR-16、miR-45、miR-223、miR-155的表達水平顯著差異，它們的表達異常與RA是密切相關的，盡管具體作用機制尚不完全明確，但有可能成為RA診斷的分子標志物及治療靶標。

本研究同時對靶基因進行了GO分析和Pathway分析，提示RA發生發展是個復雜的過程，涉及到多種信號通路，對任一通路的調控都可能對治療RA起到重要作用。本研究獲得的差異表達miRNAs的靶基因信號通路分析顯示集中在癌癥相關通路、調節肌動蛋白細胞骨架通路、泛素介導的蛋白降解通路以及趨化因子信號通路等。如Focal adhesion信號通路與RA相關［21］，該信號通路與黏著斑有關。黏著斑是將細胞外基質與細胞骨架聯系起來的多蛋白聚集體，能進行信號傳遞，引發相應的生理、病理反應。黏著斑激酶與黏著斑結合，在整合素介導的信號傳導中發揮作用，它與骨代謝、成纖維細胞的擴增及關節血管翳的生成有關［22］。

綜上所述，本研究篩選并驗證了RA患者差異表達的循環miRNAs，為進一步研究miRNAs在RA發病機制中的作用及尋找RA特異性診斷生物標志物打下了基礎。但本實驗采用早期芯片，許多新的miRNAs未包含在內。此外，樣本數量有限，仍需要進一步擴大樣本量，監測miRNAs在健康人群、RA患者血清的表達來研究驗證實驗結果的準確性和特異性。

參考文獻：

［1］中華醫學會風濕病學分會. 類風濕關節炎診斷及治療指南［J］. 中國風濕病學雜志，2010，14（4）： 265-270.

［2］ARNETT F C，EDWORTHY S M，BLOCH D A，et al. The American Rheumatism Association 1987 revised criteria for the classification of rheumatoid arthritis［J］. Arthritis Rheum，1988，31（3）: 315-324.

［3］WANG Y，STRICKER H M，GOU D，et al. MicroRNA: past and present［J］. Front Biosci，2007，12:（6）: 2316-2329.

［4］SIMPSON L J，ANSEL K M. MicroRNA regulation of lymphocyte tolerance and autoimmunity［J］. J Clin Invest，2015，125（6）: 2242-2249.

［5］STYPINSKA B，PARADOWSKA-GORYCKA A. Cytokines and microRNAs as candidate biomarkers for systemic lupus erythematosus［J］. Int J Mol Sci，2015，16（10）: 24194-24218

［6］陳芳，陳朝生，章慧娣，等. 系統性紅斑狼瘡患者外周血B淋巴細胞中狼瘡活動相關miRNA的篩選［J］. 溫州醫學院學報，2013，43（2）： 106-111.

［7］MACHADO M T，NAVEGA S，DIAS F，et al. MicroRNAs for peripheral blood fraction identification: Origin，pathways and forensic relevance［J］. Life Sci，2015，15（143）: 98-104.

［8］DAI R，AHMED S A. MicroRNA，a new paradigm for understanding immunoregulation，inflammation，and autoimmune diseases［J］. Transl Res，2011，157（4）: 163-179.

［9］SILVER N，BEST S，JIANG J，et al. Selection of housekeeping genes for gene expression studies in human reticulocytes using real-time PCR［J］. BMC Mol Biol，2006，7: 33.

［10］HUANG DA W，SHERMAN B T，LEMPICKI R A. Bioinformatics enrichment tools: paths toward the comprehensive functional analysis of large gene lists［J］. Nucleic Acids Res，2009，37（1）: 1-13.

［11］馮知濤，李娟，任潔，等. 類風濕關節炎患者外周血miR-146a及miR-16的表達及與病情活動的相關性研究［J］. 南方醫科大學學報，2011，31（2）： 320-323.

［12］MURATA K，YOSHIYOMI H，FURU M，et al. MicroRNA-451 down-regulates neutrophil chemotaxis via p38 MAPK ［J］. Arthritis Rheumatol，2014，66（3）: 549-559.

［13］LIU Q，FU H，SUN F，et al. miR-16 family induces cell cycle arrest by regulating multiple cell cycle genes［J］. Nucleic Acids Res，2008，36（16）: 5391-5404.

［14］JING Q，HUANG S，GUTH S，et al. Involvement of microRNA in AU-rich element-mediated miRNA instability［J］. Cell，2005，120（5）: 623-634.

［15］STANCZYK J，PEDRIOLI D M，BRENTANO F，et al. Altered expression of MicroRNA in synovial fibroblasts and synovial tissue in rheumatoid arthritis［J］. Arthritis Rheum，2008，58（4）: 1001-1009

［16］LIU F，FAN H，REN D，et al. TLR9-induced miR-155 and Ets-1 decrease expression of CD1d on B cells in SLE［J］. Eur J Immunol，2015，45（7）: 1934-1945.

［17］XIAO B，LIU Z，LI B S，et al. Induction of microRNA-155 during Helicobacter pylori infection and its negative regulatory role in the inflammatory response［J］. J Infect Dis，2009，200（6）: 916-925.

［18］SUN W，SHEN W，YANG S，et al. MiR-223 and miR-142 attenuate hematopoietic cell proliferation，and miR-223 positively regulates miR-142 through LMO2 isoforms and CEBP-β［J］. Cell Res，2010，20（10）: 1158-1269.

［19］FILKOVO M，ARADI B，SENOLT L，et al. Association of circulating miR-223 and miR-16 with disease activity in patients with early rheumatoid arthritis［J］. Ann Rheum Dis，2014，73（10）: 1898-1904.

［20］劉小友，徐健. Micro-RNA-223參與腎移植后急性排斥反應中的作用［J］. 細胞與分子免疫學雜志，2011，27（10）：1121-1123.

［21］ATHERTON P，STUTCHBURY B，JETHWA D，et al. Mechanosensitive components of integrin adhesions: Role of vinculin［J］. Exp Cell Res，2015，S0014-4827（15）: 30160-30169.

［22］ZHANG M M，JIANG Y S，LV H C，et al Pathway-based association analysis of two genome-wide screening data identifies rheumatoid arthritis-related pathways［J］. Genes Immun，2014，15（7）: 487-494.

（本文編輯：吳健敏）

Screening and verification of circulating miRNA biomarkers of rheumatoid arthritis

PENG Wujian1，WANG Honglei2，HUANG Jianrong1，DAI Yong3. 1. Department of Nephrology，the Third People’s Hospital of Shenzhen，Shenzhen，518020； 2.Department of Nephrology，the Third Affiliated Hospital of Southern Medical University，Guangzhou，510000； 3.Clinical Medical Research Center of the Second Clinical Medical College ，Shenzhen People’s Hospital，Jinan University，Shenzhen，518020

Abstract:Objective: To analyze the differentl expression of circulating microRNAs （miRNAs） in patients with rheumatoid arthritis （RA）. Methods: MiRNA profiles were performed to determine the differentially expressed miRNAs using RNA obtained from the plasma of patients with RA and healthy controls； to confirm array results，RT-qPCR was used for validation. GeneSpring GX software was to data processing，t-test and one way ANOVA were used for statistical analysis. Results: The array analysis identified 40 （18 upregulated miRNAs and 22 downregulated miRNAs） circulating miRNAs significantly differently expressed between RA and healthy controls，then we detected the candidate miRNAs selected based on fold-change and potential value by RT-qPCR，consistented with the data obtained from the array，the circulating level of candidate miRNAs were significantly differed in patients with RA compared with healthy controls （P＜0.05）. Conclusion: Differently expressed circulating miRNAs can be detected in patients with RA，this study indicates that circulating miRNAs may be used as a potential candidate biomarker of RA.

Key words:rheumatoid arthritis； microRNAs； array； biomarker

作者簡介：彭武建（1976-），男，湖南永順人，主治醫師，博士。

基金項目：深圳市衛生計生系統科研基金資助項目（201402033）。

收稿日期：2016-01-22

［中圖分類號］R593.22

［文獻標志碼］A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.05.005