還原型谷胱甘肽對哮喘豚鼠氣道上皮細胞的保護作用

張筠　張鐵栓　韓利

(鄭州大學第二附屬醫院 呼吸內科　河南 鄭州　450014)

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還原型谷胱甘肽對哮喘豚鼠氣道上皮細胞的保護作用

張筠張鐵栓韓利

(鄭州大學第二附屬醫院 呼吸內科河南 鄭州450014)

【摘要】目的探索還原型谷胱甘肽對哮喘豚鼠氣道上皮細胞凋亡的保護作用。方法將40只豚鼠隨機分為正常對照組、哮喘組、還原型谷胱甘肽組和地塞米松組，每組10只，應用酶聯免疫吸附測定法(ELISA)檢測支氣管肺泡灌洗液中的干擾素-r(INF-r)水平及肺組織總抗氧化能力(T-AOC)，原位末端轉移酶標記染色法(TUNEL染色)檢測氣道上皮細胞凋亡情況，逆轉錄-聚合酶鏈反應(RT-PCR)測定肺組織B淋巴細胞/白血病-2信使核糖核酸(Bcl-2 mRNA)的表達。結果與哮喘組相比，還原型谷胱甘肽組支氣管肺泡灌洗液中干擾素-r(INF-r)顯著升高(P<0.05)，與地塞米松組相似(P>0.05)，氣道上皮細胞凋亡指數(apoptosis index，AI)顯著降低(P<0.05)，肺組織T-AOC測定及Bcl-2 mRNA的表達均顯著升高(P<0.05)。結論還原型谷胱甘肽對哮喘豚鼠氣道上皮細胞凋亡具有保護作用。

【關鍵詞】哮喘；還原型谷胱甘肽；凋亡

支氣管哮喘是較為常見的呼吸系統疾病之一，發病率近年有上升趨勢，不僅對個人身體造成嚴重影響，也為社會增加負擔。因其本質是氣道慢性炎癥，Que等[1]通過對哮喘患者行肺部活檢發現其呼吸道上皮細胞凋亡增加，同時，體外實驗也證明，在強氧化劑的作用下哮喘患者的呼吸道上皮細胞更容易發生凋亡。還原型谷胱甘肽作為一種重要的在細胞內外均有保護作用的抗氧化劑，本文研究其對哮喘的氣道上皮細胞凋亡是否具有保護作用，可為臨床治療提供新的方向。

1材料與方法

1.1實驗動物健康豚鼠40只，雌雄各20只，購于鄭州大學醫學院實驗動物中心，體質量(450±25)g，于清潔通風環境中分籠喂養。將40只豚鼠隨機分為正常對照組、哮喘組、地塞米松組和還原型谷胱甘肽組，每組10只。

1.2主要試劑與儀器雞卵白蛋白(美國Sigma公司)，還原型谷胱甘肽(阿拓莫蘭)注射液(重慶藥友制藥責任有限公司)，原位細胞凋亡檢測試劑盒(POD)(德國Boehringer Mannheim公司)，圖像記錄分析系統(D-14)(大連競邁生物科技有限公司)。

1.3實驗方法

1.3.1動物模型準備采用雞卵白蛋白致敏和激發建立豚鼠哮喘模型，第1天腹腔內注射2%雞卵白蛋白氫氧化鋁凝膠2 ml致敏豚鼠，第8天重復注射加強致敏，第21天吸入2%雞卵白蛋白生理鹽水激發哮喘發作，霧化吸入10 min前腹腔注射生理鹽水2 ml，共7 d，以豚鼠腹肌出現明顯收縮、嗆水、喘鳴等呼吸道阻塞癥狀為造模成功[2]。

1.3.2干預正常對照組：第1天腹腔內注射生理鹽水2 ml，第8天重復注射，第21天吸入生理鹽水10 ml/10 min，霧化吸入10 min前腹腔注射生理鹽水2 ml，共7 d。地塞米松組：誘發前給予2 ml地塞米松2 mg/(kg·d)劑量配比液腹腔注射，共7 d。還原型谷胱甘肽組：誘發前給予2 ml還原型谷胱甘肽0.1 g/(kg·d)劑量配比液腹腔注射，共7 d。

1.3.3標本留取與檢測全部豚鼠于末次激發后24 h，腹腔注射10%烏拉坦1.5 ml麻醉，以開胸后心臟采血的方法處死，用聚乙烯導管插入右肺總支氣管，37.0 ℃生理鹽水3 ml/次緩慢灌洗右肺，反復3次，收集回收液離心，取上清液進行ELISA法測定INF-r，再沿左支氣管走形方向取肺組織，分4等份，分別采用ELISA法測定T-AOC，行TUNEL染色計算細胞凋亡指數(apoptosis index，AI)，做電鏡切片及RT-PCR技術檢測Bcl-2 mRNA。

1.4統計學處理應用SPSS 13.0軟件進行單因素方差分析及LSD-t檢驗，P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1動物性狀變化正常對照組豚鼠肥大強壯，精神良好，飲食正常，活潑愛動，口唇紅潤，皮毛有光澤且不易脫落。哮喘組豚鼠發育不良，精神萎靡，飲食及活動量少，口唇發紺，皮毛枯槁且有脫毛。還原型谷胱甘肽組和地塞米松組性狀較哮喘組輕，雖存在一定程度的精神萎靡，飲食及活動量少，但無口唇發紺及脫毛現象。

2.2支氣管肺泡灌洗液INF-r檢查結果正常對照組INF-r明顯高于哮喘組、還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，哮喘組INF-r明顯低于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，而還原型谷胱甘肽組及地塞米松組INF-r差異無統計學意義(P>0.05)。見表1。

表1　支氣管肺泡灌洗液INF-r檢測結果

注：與正常對照組比較，aP<0.001；與哮喘組比較，bP<0.001；與還原型谷胱甘肽組比較，cP>0.05。

2.3肺組織T-AOC的測定正常對照組T-AOC高于哮喘組、還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，哮喘組T-AOC明顯低于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，還原型谷胱甘肽組T-AOC高于地塞米松組(P<0.05)。見表2。

2.4氣道上皮細胞凋亡的檢測通過TUNEL染色對氣道上皮凋亡的檢測中發現，各組豚鼠氣道上皮細胞均存在不同程度的凋亡現象。正常對照組氣道上皮凋亡明顯低于哮喘組、還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，哮喘組氣道上皮凋亡明顯高于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，而氣道上皮凋亡在還原型谷胱甘肽組及地塞米松組間差異無統計學意義(P>0.05)。見表3及圖1。

表2　各組豚鼠肺組織T-AOC比較

注：與正常對照組比較，dP<0.001；與哮喘組比較，eP<0.001；與還原型谷胱甘肽組比較，fP<0.001。

表3　各組豚鼠氣道上皮凋亡指數比較±s)

注：與正常對照組比較，gP<0.001；與哮喘組比較，hP<0.001；與還原型谷胱甘肽組比較，iP>0.05。

A為正常對照組；B為哮喘組；C為地塞米松組；D為還原型谷胱甘肽組。

圖1各組氣道上皮細胞凋亡圖

2.5電鏡結果正常對照組氣道上皮細胞結構基本正常，僅有少部分細胞腫脹，細胞器完整。哮喘組支氣管上皮細胞重度腫脹，細胞膜消失，細胞質內容溢出，細胞結構消失。地塞米松組支氣管上皮細胞單層排列，部分細胞明顯腫脹，細胞質內線粒體嵴溶解、消失，空泡樣改變。還原型谷胱甘肽組支氣管上皮細胞單層排列，部分細胞腫脹，細胞質內線粒體豐富，部分線粒體呈腫脹狀態，另可見少量的粗面內質網、核糖體、高爾基復合體及溶酶體等細胞器。見圖2。

E為正常對照組；F為哮喘組；G為地塞米松組；H為還原型谷胱甘肽組。

圖2各組支氣管上皮細胞電鏡圖

2.6各組豚鼠肺組織Bcl-2mRNA的表達正常對照組Bcl-2 mRNA的表達高于哮喘組、還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，哮喘組Bcl-2 mRNA的表達明顯低于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，還原型谷胱甘肽組Bcl-2 mRNA的表達高于地塞米松組(P<0.05)。見表4和圖3。

表4　各組豚鼠肺組織Bcl-2 mRNA的表達

注：與正常對照組比較，jP<0.001；與哮喘組比較，kP<0.001；與還原型谷胱甘肽組比較，lP<0.001。

圖3　各組豚鼠肺組織Bcl-2 mRNA的表達情況

3討論

有研究顯示哮喘炎癥反應使氧自由基產生增加，導致氧化應激，肺組織抗氧化能力下降，支氣管上皮凋亡增加，氣道上皮損傷[3-4]。那么，維持氧化-抗氧化平衡可能成為治療哮喘的新出發點[5]。還原型谷胱甘肽是一個在哺乳動物細胞中普遍存在的包括巰基的三肽(左旋谷氨酰半胱氨酸-甘氨酸)。它是一個重要的有保護作用、抗自由基和其它氧化劑作用的抗氧化劑，而且它還涉及免疫調節和炎癥反應[6]。抗氧化劑還原型谷胱甘肽具有重要的肺抗氧化劑防御功能，尤其在保護上皮(基膜完整性)不受氧化/自由基(香煙/空氣微粒)介導的損傷和炎癥，它在保持氣道上皮細胞完整性，抵御肺部損傷與炎癥等方面起重要作用[7-8]。

正常情況下呼吸道上皮細胞數目保持相對穩定，呼吸道上皮可發生較低水平的增殖，同時存在相應的自發性凋亡，兩者受到凋亡-抗凋亡和增殖-抗增殖的精密調節，呼吸道上皮凋亡是哮喘的重要病理特征，也是哮喘不同于其他慢性呼吸道疾病呼吸道重塑的重要特征[9]。糖皮質激素雖被證實在大多數情況下能很好地控制氣道炎癥，但對呼吸道重塑特別是呼吸道上皮細胞凋亡的作用仍存爭議[10]。細胞凋亡由多種基因控制，參與細胞凋亡的相關基因多達數十種，根據功能不同大致可分為3類。凋亡促進基因：P53、WAF1、myc、Fas/FAS配體等；凋亡抑制基因：Bcl-2、IAP、Bak、EIB、Bax；雙向調節基因：C-myc、Bcl-X等。其中Bcl-2的研究最為詳細。Bcl-2是B淋巴細胞/白血病-2(B cell lympona/leukemia-2)基因的縮寫形式，它是第1個被確認具有抑制凋亡作用的基因，主要分布在線粒體內膜、細胞內膜表面、內質網、核膜等處，廣泛存在于上皮細胞、造血細胞、神經細胞、淋巴細胞及多種瘤細胞。目前認為，Bcl-2主要通過以下機制抗凋亡[11-12]：直接抗氧化；抑制線粒體釋放促凋亡蛋白質；抑制促凋亡調節蛋白Bax、Bak的細胞毒作用；抑制凋亡蛋白酶的激活；維持細胞鈣穩態。本研究通過以下幾方面證實了還原型谷胱甘肽對哮喘豚鼠氣道上皮細胞凋亡具有保護作用：一般性狀變化較輕；支氣管肺泡灌洗液中INF-r顯著升高；電鏡結果顯示支氣管上皮細胞、細胞器病理改變較輕；氣道上皮細胞凋亡程度較輕；Bcl-2 mRNA表達上調。這提示還原型谷胱甘肽可能通過清除氧自由基的功能影響細胞內信號轉導，從而影響調節細胞凋亡的某些基因或者蛋白的表達，如還原型谷胱甘肽上調了Bcl-2 mRNA的表達，從而抑制氣道上皮細胞的凋亡。

哮喘研究中對Th1/Th2細胞失衡機制關注較多。作為Th1的代表因子，INF-r是評估哮喘病情的重要指標。糖皮質激素作為哮喘治療的一線用藥，其可通過提高INF-r改善Th1/Th2細胞失衡狀態，本研究結果與之相符合，但長期應用糖皮質激素，相關副作用也逐漸被廣泛關注。哮喘組INF-r明顯低于還原型谷胱甘肽組及地塞米松組(P<0.05)，而還原型谷胱甘肽組及地塞米松組INF-r差異無統計學意義(P>0.05)，提示還原型谷胱甘肽與糖皮質激素在調節Th1/Th2細胞失衡機制中有著相似的作用。本項研究為哮喘的治療帶來了新的思路，但其能否在臨床推廣，尚需進一步研究。

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Protective function of reducing glutathione on airway epithelial cells in guinea pig models of asthma

Zhang Yun，Zhang Tieshuan，Han Li

(DepartmentofRespiratoryMedicine，theSecondAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity，Zhengzhou450014，China)

【Abstract】ObjectiveTo study the protective function of reducing glutathione on airway epithelial cells in guinea pig models of asthma. MethodsForty guinea pigs were randomly divided into 4 groups: control group, asthma group, reducing glutathione group and dexamethasone group, 10 guinea pigs in each group. INF-r level in bronchoalveolar lavage fluid was detected by enzyme linked immunosorbent assay. TUNEL was used to detect the level of epithelial cells and RT-PCR was used to determine the status of Bcl-2mRNA in lung tissue. ResultsCompared with asthma group, the INF-r levels in bronchoalveolar lavage fluid of reducing glutathione group were statistically higher(P<0.05), similar with that in the dexamethasone group(P>0.05).The levels of T-AOC and Bcl-2 mRNA in lung tissue of reducing glutathione group were significantly upper compared with asthma group(P<0.05). ConclusionReducing glutathione have the ability to protect airway epithelium in guinea pig models of asthma.

【Key words】asthma；reducing glutathione；apoptosis

(收稿日期：2015-09-25)

【中圖分類號】R 392.3

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.04.005

通訊作者：張鐵栓，E-mail：huxizhangtieshuan@163.com。