Stathmin基因畢赤酵母表達(dá)體系的構(gòu)建及鑒定*

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710038)

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·論著·

Stathmin基因畢赤酵母表達(dá)體系的構(gòu)建及鑒定*

(第四軍醫(yī)大學(xué)唐都醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室,陜西西安 710038)

摘要:目的構(gòu)建Stathmin基因畢赤酵母表達(dá)體系，并對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行純化和鑒定，為Stathmin相互作用蛋白的進(jìn)一步研究提供實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。方法通過(guò)PCR方法從SKBR3乳腺癌細(xì)胞中擴(kuò)增出人Stathmin基因片段，克隆入畢赤酵母表達(dá)載體pPIC3.5K，構(gòu)建重組載體pPIC3.5K-Stathmin，轉(zhuǎn)化GS115工程菌，經(jīng)含基因素(G418)的酵母膏胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基篩選出陽(yáng)性克隆。用0.5%甲醇誘導(dǎo)表達(dá)，并用十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)及Western Blotting鑒定表達(dá)產(chǎn)物。結(jié)果DNA測(cè)序結(jié)果表明，所獲基因片段與Stathmin基因序列一致。在含有G418 600 μg/mL的YPD培養(yǎng)基上篩選出的pPIC 3.5K-Stathmin轉(zhuǎn)化子，經(jīng)PCR鑒定為陽(yáng)性克隆。SDS-PAGE可見約 37×103處有目的條帶表達(dá)，經(jīng)Western Blotting鑒定，此條帶為Stathmin蛋白。結(jié)論成功構(gòu)建了Stathmin酵母表達(dá)載體，并在畢赤酵母中表達(dá)成功，為Stathmin相互作用蛋白研究以及生物治療藥物的制備奠定了基礎(chǔ)。

關(guān)鍵詞:基因；畢赤酵母表達(dá)體系；鑒定

Stathmin是一種高度保守的細(xì)胞質(zhì)磷蛋白，通過(guò)其磷酸化和去磷酸化高效調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖和分化[1]。國(guó)內(nèi)外研究均表明Stathmin蛋白與多種腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)[2-4]，并與腫瘤組織學(xué)分級(jí)、病情進(jìn)展以及預(yù)后相關(guān)[5]。Stathmin被認(rèn)為是潛在的腫瘤標(biāo)志物和腫瘤治療新靶點(diǎn)[6]。為進(jìn)一步深入探討以Stathmin為靶點(diǎn)的應(yīng)用研究，Stathmin表達(dá)體系的建立至關(guān)重要，而原核表達(dá)體系雖然周期短、表達(dá)產(chǎn)量高，但目的蛋白常以包涵體形式表達(dá)，導(dǎo)致產(chǎn)物純化困難，且原核表達(dá)系統(tǒng)翻譯后加工修飾體系不完善，表達(dá)產(chǎn)物的生物活性較低，不能滿足進(jìn)一步研究的需要。所以研究者構(gòu)建了Stathmin畢赤酵母真核表達(dá)體系，純化His-Stathmin蛋白，為發(fā)現(xiàn)新的Stathmin拮抗蛋白和新的腫瘤生物治療藥物奠定基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料pPIC3.5K載體和pichia host strain購(gòu)自Invitrogen公司。E.coliJM109為本實(shí)驗(yàn)室保存。限制性內(nèi)切酶EcoRⅠ、NotⅠ、SalⅠ、Tap DNA聚合酶、T4DNA連接酶，均購(gòu)自Takara公司。Anti-His抗體購(gòu)自中衫金橋公司，Anti-Stathmin抗體購(gòu)自cell singaling公司，其他常規(guī)試劑為本實(shí)驗(yàn)室保存。引物由北京奧科鼎盛生物科技有限公司合成；引物序列如下：Stathmin-F：5′-TTT TCC TTT TGC GGC CGC TTA GTC AGC TTC AGT CTC G -3′，其中下劃線部分為Notc酶切位點(diǎn)； Stathmin-R：5′-CG GAA TTC CAC CAC CAC CAC CAC CAC ATG GCT TCT TCT GAT-3′，其中下劃線部分為EcoRⅠ酶切位點(diǎn)，波浪線部分為His標(biāo)簽。

1.2方法

1.2.1Stathmin基因片段擴(kuò)增根據(jù)GeneBank(X53305)人Stathmin基因序列，設(shè)計(jì)合成用于擴(kuò)增Stathmin全長(zhǎng)基因的Stathmin-F,Stathmin-R引物，提取乳腺癌細(xì)胞系SKBR3細(xì)胞總RNA,反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板，常規(guī)PCR方法擴(kuò)增Stathmin全長(zhǎng)基因。反應(yīng)體系按照說(shuō)明書進(jìn)行，PCR反應(yīng)條件為94 ℃ 3 min，94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 40 s，30個(gè)循環(huán)，72 ℃ 10 min。

1.2.2重組pPIC3.5K質(zhì)粒建立用EcoRⅠ和NotⅠ分別雙酶切全長(zhǎng)Stahtmin基因片段及pPIC3.5K載體37 ℃，4 h。瓊脂糖電泳后分別回收目標(biāo)片段并純化。將Stathmin基因克隆入pPIC3.5K載體相應(yīng)位點(diǎn)，用氯化鈣法轉(zhuǎn)化入E.coli JM109感受態(tài)，挑取菌落，提取質(zhì)粒，經(jīng)雙酶切和PCR鑒定，篩選陽(yáng)性克隆命名為pPIC3.5K-Stathmin并且進(jìn)行基因測(cè)序，確定沒有突變。

1.2.3酵母感受態(tài)的制備 挑取酵母菌GS115于100 mL酵母膏胨葡萄糖瓊脂(YPD)培養(yǎng)基中，28 ℃，250 r/min培養(yǎng)16 h，待OD值達(dá)1.0～1.5，4 000 r/min，5 min，4 ℃離心集菌。沉淀用50 mL預(yù)冷滅菌水洗滌1次，再用20 mL預(yù)冷1 mol山梨醇洗滌1次后，用1 mL山梨醇重懸后冰浴。制備成酵母菌GS115感受態(tài)。

1.2.4Stathmin酵母表達(dá)載體的構(gòu)建重組質(zhì)粒pPIC3.5K-Stathmin用Sal1內(nèi)切酶線性化處理，電轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)入GS115感受態(tài)后，涂布于MD平板，28 ℃培養(yǎng)48 h。將培養(yǎng)出的克隆稀釋后涂布到含有G418分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 μg/mL的YPD平板，28 ℃孵育2～3 d，篩選出高拷貝克隆。挑取單克隆至MGY液體培養(yǎng)基中，28 ℃培養(yǎng)48 h后提取酵母菌基因組DNA，用PCR鑒定Stathmin與酵母基因組是否整合成功。

1.2.5甲醇誘導(dǎo)表達(dá)及鑒定取PCR鑒定陽(yáng)性克隆接種于5 mL BMGY培養(yǎng)液中，于28 ℃培養(yǎng)18 h，至OD600為2.0～6.0時(shí)，2 000 r/min離心5 min集菌，用適量BMMY培養(yǎng)液重懸，使OD600值在1.0～1.2。加入甲醇溶液誘導(dǎo)表達(dá)，使甲醇總濃度維持在0.5%，每24 h補(bǔ)充1次甲醇。培養(yǎng)96 h后，用Western Blotting對(duì)表達(dá)產(chǎn)物進(jìn)行鑒定，并以pPIC3.5K空載體為陰性對(duì)照。

1.2.6Stathmin蛋白的純化和鑒定采用Anti-His-tag親和層析柱對(duì)Stathmin蛋白進(jìn)行純化。收集誘導(dǎo)表達(dá)的畢赤酵母，加液氮研磨破壁20 min，用1 mL PBS進(jìn)行重懸，4 000 r/min離心5 min后，取上清14 000 r/min離心4 min，再用0.45 nm濾膜過(guò)濾后，加入Anti-His-tag親和層析柱進(jìn)行純化，收集流穿液。用5倍床體積PBS進(jìn)行洗柱后，再用50、100、150、200 mmol/L咪唑分別進(jìn)行洗脫。并將洗脫液收集，通過(guò)十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(SDS-PAGE)和Western Blotting對(duì)Stathmin蛋白進(jìn)行鑒定。

2結(jié)果

2.1Stathmin基因片段擴(kuò)增結(jié)果以乳腺癌SKBR3細(xì)胞cDNA為模板，PCR擴(kuò)增Stathmin基因片段，經(jīng)瓊脂糖凝膠電泳，可見一條約450 bp的片段，與預(yù)期Stathmin基因片段大小符合，見圖1。

2.2重組pPIC3.5K-Stathmin質(zhì)粒的鑒定重組質(zhì)粒經(jīng)EcoRⅠ和NotⅠ雙酶切，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳，可見一條9 000 bp和一條450 bp的條帶，符合預(yù)期，見圖2。陽(yáng)性克隆送北京奧科鼎盛生物科技有限公司進(jìn)行測(cè)序鑒定結(jié)果顯示序列正確，與Genebank X53305一致，見圖3(見《國(guó)際檢驗(yàn)醫(yī)學(xué)雜志》網(wǎng)站主頁(yè)“論文附件”)。

M:DNA標(biāo)志物DL2000；1:Stathmin PCR產(chǎn)物。

圖1瓊脂糖凝膠電泳Stathmin基因片段PCR擴(kuò)增結(jié)果

M:DNA標(biāo)志物DL2000；1:pPIC3.5K-Stathmin。

圖2pPIC3.5K-Stathmin重組表達(dá)載體的雙酶切鑒定結(jié)果

2.3重組畢赤酵母菌的構(gòu)建、篩選和鑒定在含有0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL不同梯度G418的YPD固體培養(yǎng)基上抗性篩選畢赤酵母轉(zhuǎn)化子，提取基因組DNA為模板，進(jìn)行PCR鑒定，出現(xiàn)預(yù)期450 bp的條帶,見圖4。

M:DNA標(biāo)志物DL2000；1:pPIC3.5K空載體；2～6:分別為0.25、0.5、1.0、1.5、2.0 mg/mL G418 YPD 篩選的pPIC3.5K-Stathmin轉(zhuǎn)化子。

圖4pPIC3.5K-Stathmin重組轉(zhuǎn)化的

畢赤酵母的PCR鑒定

2.4目的蛋白的純化和鑒定采用Anti-His-tag親和層析柱對(duì)表達(dá)的Stathmin蛋白進(jìn)行純化。經(jīng)SDS-PAGE電泳，考馬斯亮藍(lán)染色，凝膠上出現(xiàn)相對(duì)分子質(zhì)量約為35×103的條帶,見圖5。分別用His抗體和Stathmin抗體進(jìn)行Western Blotting鑒定，分別在膠片上同樣相對(duì)分子質(zhì)量大小出現(xiàn)條帶，蛋白鑒定為Stathmin蛋白。相對(duì)分子質(zhì)量較預(yù)期19×103偏大，與添加His標(biāo)簽和蛋白糖基化有關(guān)，空載體轉(zhuǎn)化的畢赤酵母菌作為陰性對(duì)照，沒有出現(xiàn)相應(yīng)條帶，見圖6。

M:蛋白質(zhì)標(biāo)志物；1:培養(yǎng)液上清;2:上樣液;3:流穿液;4:PBS洗脫液;5～8:分別為50、100、150、200 mmol/L咪唑洗脫液;9:PBS洗脫液。

圖5SDS-PAGE 鑒定表達(dá)和純化的Stathmin蛋白

1:陽(yáng)性對(duì)照；2:陰性對(duì)照；3:Stathmin蛋白。

圖6Western Blotting鑒定Stathmin蛋白

3討論

Stathmin是一種由149個(gè)氨基酸殘基組成的可溶性、高度保守的細(xì)胞質(zhì)磷蛋白。它的相對(duì)分子質(zhì)量約為19×103，分為2個(gè)區(qū)域。一個(gè)是N端的“磷酸化”區(qū)域，其含有Ser16、Ser25、Ser38和Ser63共4個(gè)絲氨酸磷酸化位點(diǎn)[7]。另一個(gè)是C端的“功能”區(qū)域，該區(qū)域可以和微管的α/β異源二聚體螯合形成緊密的T2S三聚體復(fù)合物，從而調(diào)節(jié)微管蛋白的功能[8]。該蛋白廣泛存在于各種脊椎動(dòng)物細(xì)胞中，主要通過(guò)與微管系統(tǒng)作用發(fā)揮功能，Stathmin蛋白作為一種基本的微管解離蛋白，通過(guò)結(jié)合微管蛋白參與微管和紡錘體的組裝和活化調(diào)節(jié)。此外，Stathmin不僅能和多種其他蛋白結(jié)合，也是許多細(xì)胞內(nèi)蛋白激酶的底物,Stathmin還在不同的細(xì)胞周期通過(guò)修飾Stathmin蛋白的不同磷酸化位點(diǎn)而改變微管蛋白的聚合從而調(diào)控細(xì)胞的增殖、分化和運(yùn)動(dòng)[9-11]；同時(shí)，許多癌基因及抑癌基因的表達(dá)產(chǎn)物，還有大量的細(xì)胞因子均可通過(guò)不同的方式與Stathmin作用而引起腫瘤細(xì)胞生物學(xué)行為的改變。另外，Stathmin可以作為信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)子，參與信號(hào)通路活性調(diào)節(jié)，在細(xì)胞的生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中發(fā)揮了非常重要的作用。Stathmin與腫瘤的發(fā)生發(fā)展關(guān)系密切，作為潛在的腫瘤標(biāo)志物和新的腫瘤生物治療靶點(diǎn)，Stathmin蛋白表達(dá)系統(tǒng)的建立對(duì)進(jìn)一步研究腫瘤靶向治療藥至關(guān)重要。

畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)與傳統(tǒng)的大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)相比，畢赤酵母作為單細(xì)胞真核生物，不但具有原核生物生長(zhǎng)快速、培養(yǎng)基廉價(jià)和實(shí)驗(yàn)手段簡(jiǎn)單等特點(diǎn)，還具備真核生物可對(duì)表達(dá)蛋白進(jìn)行加工折疊和翻譯后修飾等生物學(xué)特性，并且克服了原核表達(dá)系統(tǒng)表達(dá)產(chǎn)物多以包涵體形式存在，復(fù)性困難且效率低下，背景蛋白多、不易純化的缺點(diǎn)。而相較釀酒酵母表達(dá)體系，畢赤酵母具有更強(qiáng)有力的啟動(dòng)子、分泌效率有所提高，表達(dá)質(zhì)粒更穩(wěn)定等特性。并且還具有可以通過(guò)高密度發(fā)酵獲得大量產(chǎn)物，且分泌產(chǎn)物無(wú)過(guò)度糖基化，臨床應(yīng)用安全等特點(diǎn)[12]。本研究使用pPIC3.5K載體構(gòu)建Stathmin畢赤酵母表達(dá)體系，使用的醇氧化酶基因(AOX)啟動(dòng)子為強(qiáng)誘導(dǎo)型啟動(dòng)子，可有效地調(diào)控外源基因的高效表達(dá)。在Stathmin蛋白上加入了6×His-tag表達(dá)標(biāo)簽，用優(yōu)質(zhì)帶鎳離子的親和純化柱進(jìn)行純化，目標(biāo)蛋白純度高，方法簡(jiǎn)單。

構(gòu)建Stathmin畢赤酵母表達(dá)體系，純化Stathmin蛋白，將有利于發(fā)現(xiàn)Stathmin蛋白的拮抗蛋白或多肽，為新的腫瘤生物治療靶向藥物的產(chǎn)生奠定基礎(chǔ)。同時(shí)，也可以更好地研究Stathmin 蛋白與其他蛋白相互作用關(guān)系以及Stathmin在信號(hào)通路中的作用，進(jìn)一步深入地了解Stathmin在腫瘤發(fā)生發(fā)展中的作用。Stathmin 作為新的腫瘤標(biāo)志物和腫瘤生物治療新靶點(diǎn)，將發(fā)揮更加重要的作用，成功構(gòu)建Stathmin畢赤酵母表達(dá)體系為Stathmin的進(jìn)一步研究奠定重要基礎(chǔ)。

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Construction and identification of Stathmin gene Pichia pastoris expression system*

YangMing,LinFang,HeTing,DongKe,ZhangHuizhong△

(CentralLaboratory,TangduHospital,theFourthMilitaryMedicalUniversity,Xi′an,Shaanxi710038,China)

Abstract:ObjectiveTo provide the experimental basis for the further research of the interacting proteins with Stathmin，the Stathmin gene Pichia pastoris expression system was constructed，the expressed Stathmin product was purified and identified.MethodsStathmin gene was amplified from tumor cell line of SKBR3 by PCR method and cloned into the yeast expression vector pPIC3.5K.The recombinant vector pPIC3.5K-Stathmin was constructed and transformed into Pichia pastoris GS115.The positive clones were screened by YPD medium containing Geneticin 600 μg/mL.Expression was induced with 0.5% methanol and expression products were identified by SDS-PAGE and Western Blotting.ResultsDNA sequencing result showed that the gene fragment was consistent with Stathmin gene sequence.pPIC3.5K-Stathmin was selected from YPD culture medium containing Geneticin,and the positive clones were identified by PCR.SDS-PAGE showed that a 37×103 protein band could be seen on the PAGE gel after Coomassie Blue staining,which was further confirmed and identified as Stathmin protein by Western Blotting.ConclusionStathmin yeast expression vector is successfully constructed and expressed in Pichia pastoris,which laid the foundation for the study of interacting proteins with Stathmin,and for the preparation of the biological treatment drugs of Stahtmin target.

Key words:gene;Pichia pastoris expression system；identify

(收稿日期：2015-12-28)

DOI:10.3969/j.issn.1673-4130.2016.09.001

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

文章編號(hào)：1673-4130(2016)09-1161-03

*基金項(xiàng)目：國(guó)家自然科學(xué)基金資助項(xiàng)目(81372836)。

作者簡(jiǎn)介：楊銘，女，檢驗(yàn)技師，主要從事腫瘤生物治療研究。△通訊作者，E-mail：zhz328@yahoo.com.cn。

楊銘,林芳,和婷,董軻,張惠中△