加味升降散對病毒感染后小鼠呼吸道上皮VR1表達及肺內P物質含量的影響

黃漢超，陳　寧，趙海方

(廣東省第二中醫院，廣東 廣州 510095)

?

加味升降散對病毒感染后小鼠呼吸道上皮VR1表達及肺內P物質含量的影響

黃漢超，陳寧，趙海方

(廣東省第二中醫院，廣東 廣州 510095)

[摘要]目的探討加味升降散對病毒感染后小鼠呼吸道上皮辣椒素受體(VR1)表達及P物質含量的影響。方法將40只SPF級小鼠隨機分為治療組與對照組，均采用甲型流感病毒FMl株造模，造模成功后治療組予加味升降散灌胃，對照組予蒸餾水灌胃，連續2周。末次灌胃后24 h處死小鼠,電鏡下觀察呼吸道上皮病理變化，PCR法檢測呼吸道上皮VR1 mRNA表達量，ELISA法檢測肺組織勻漿上清液中P物質含量。結果治療組小鼠呼吸道上皮VR1 mRNA的表達量及肺組織勻漿P物質含量均明顯低于對照組(P均<0.05)，并且呼吸道上皮纖毛有修復現象。結論加味升降散對病毒感染后小鼠呼吸道上皮具有修復作用。

[關鍵詞]加味升降散；小鼠；辣椒素受體；P物質；病毒感染

感染后咳嗽是臨床常見病、多發病之一，多以刺激性干咳、咽癢、咳少許白色痰等為主要表現，X射線胸片、血常規檢查多無異常。該病病程纏綿，可以持續3～8周甚至更長時間，頻繁的就診不僅加重了患者的經濟負擔，而且還影響患者休息、工作。隨著氣候變遷、大氣污染加重,本病發病率有上升趨勢。該病發病機制較為復雜，目前尚未完全明確，可能與變態反應[1]以及神經源性刺激[2]等因素有關。最新的動物實驗研究表明造成感染后咳嗽的原因可能與呼吸道上皮辣椒素受體(VR1)表達升高、P物質釋放增多有關[3]。筆者在臨床上運用加味升降散治療感冒后咳嗽有一定的臨床療效[4]，現擬通過動物實驗了解該藥對小鼠呼吸道上皮VR1的表達及肺內P物質含量的影響，旨在闡明該方的作用機制以及臨床應用價值。

1實驗資料

1.1藥品與試劑加味升降散組方：顆蟬蛻1包(相當于生藥6 g)， 顆僵蠶1包(相當于生藥10 g)， 顆姜黃1包(相當于生藥6 g)， 顆大黃1包(相當于生藥6 g) ， 顆百部1包(相當于生藥10 g)，顆白前1包(相當于生藥10 g，顆枳實1包(相當于生藥6 g)， 顆厚樸1包(相當于生藥6 g)，顆麻黃1包(相當于生藥5 g)， 顆苦杏仁1包(相當于生藥10g，顆甘草1包(相當于生藥3 g)， 顆桑葉1包(相當于生藥10 g)，顆牛蒡子1包(相當于生藥10 g)。所選中藥配方顆粒劑由廣東一方制藥有限公司提供。提取RNA的Trizol試劑盒來自Takara公司，逆轉錄試劑盒來自美國DBI公司；酶聯免疫吸附測定(ELISA)試劑盒購自美國R&D 公司，批號：201403；VR1的上游引物序列為CCGGCTTTTTGGGAAGGGT，下游引物序列為GAGACAGGTAGGTCCATCCAC。

1.2動物40只SPF級NIH小鼠購自廣東省醫學實驗動物中心，雌雄各半，許可證號SCXK(粵)2013-0002。根據體質量末位數進行分組，其中尾數為1，3，5，7，9的小鼠歸入治療組，尾數為0，2，4，6，8的小鼠歸入對照組，每組20只。

1.3儀器TGL-16G型高速離心機購自上海安亭科學儀器廠；UV-1206型分光光度計購自日本SHIMODZU公司；PCR擴增儀購自美國ABI公司；Real time PCR儀購自美國Agilent公司；華東電子DG5033A酶標儀購自南京華東電子集團醫療裝備有限責任公司；ADVIA1800全自動生化分析儀購自德國西門子公司。

1.4實驗方法

1.4.1病毒培養病毒實驗操作在廣州中醫藥大學熱帶醫學研究所屬下的病毒學實驗室進行。選用甲型流感病毒FMl株，由中國藥品生物檢定所提供，經小鼠增強毒力后，于雞胚尿囊腔傳代2次，并測定其半數致死量。實驗前，取毒種流水沖浸融化，以無菌生理鹽水倍比稀釋成10-5的濃度，放冰水中保存。

1.4.2病毒接種在SPF級環境下單獨飼養SPF級小鼠1周左右后開始接種病毒。在乙醚輕度麻醉下，用已滴定流感病毒稀釋液滴鼻感染，每鼠2滴，約0.05 mL，觀察7 d，2組均未發生死亡。

1.4.3中藥灌胃病毒接種第8天，治療組給予加味升降散溶液灌胃，用100 mL開水融化中藥后放置室溫，每只小鼠每次灌胃0.2 mL，每天2次，連續灌胃2周；對照組小鼠予蒸餾水灌胃。

1.5檢測項目及方法

1.5.1呼吸道上皮電鏡檢查末次灌胃后24 h處死小鼠并采血完畢后取出一側肺，用生理鹽水沖洗干凈，在肺門處用無菌手術刀片橫切厚約1 mm的薄片，用2.5%戊二醛固定液固定后經過脫水、浸透、包埋、切片、電子染色后制成電鏡標本進行觀察。

1.5.2VR1 mRNA表達量檢測2組病毒接種后7 d及末次灌胃后24 h各處死10只小鼠后取適量右側肺組織，在液氮中充分研磨，加入Trizol試劑，震蕩混勻室溫放置5 min后加入氯仿進行離心處理，取上清液，并根據試劑盒說明書進行RNA提取、去基因組、逆轉錄、擴增、PCR檢測等。實驗按照2-△△Ct方法處理數據。其中，△Ct=(目的基因Ct-內參Ct)的平均值±標準偏差；△△Ct=(待測樣品中目的基因△Ct-參照樣品中目的基因△Ct)的平均值±標準偏差。

1.5.3肺內P物質含量檢測2組病毒接種后7 d及末次灌胃后24 h各處死10只小鼠后取游離右側肺，取適量肺組織，加入醋酸溶液后100 ℃水浴10 min，然后按比例加入一定量的PBS液，以3 500 r/min的速度離心20 min，取上清液后用ELISA法檢測小鼠肺組織P物質的含量，操作及方法按試劑盒說明書進行。

1.5.4安全性分析在給藥前采用剪尾采血的方法采集標本約0.1 mL，給藥后在取小鼠肺前打開胸腔，用1 mL注射器刺入小鼠心臟采血約0.2 mL，查血常規、肝腎功能(ALT、AST、BUN、Cr)。

2結果

2.12組小鼠呼吸道上皮電鏡下表現治療組呼吸道黏膜纖毛脫失，排列尚完整，見圖1；呼吸道黏膜上皮尚完整，有部分細胞脫落，見圖2；呼吸道上皮細胞粗面內質網腫脹，尚可看到完整的細胞核，見圖3。對照組呼吸道黏膜纖毛倒伏、脫失嚴重，排列不完整，見圖4；呼吸道黏膜上皮斷裂，有細胞脫落，見圖5；呼吸道上皮細胞粗面內質網嚴重腫脹，難以看到完整的細胞器，見圖6。

圖1　治療組小鼠呼吸道上皮纖毛形態(×100 000)

圖3　治療組小鼠呼吸道上皮細胞透射電鏡表現(×100 000)

2.22組給藥前后小鼠呼吸道上皮VR1mRNA表達量及肺組織勻漿P物質含量比較2組給藥前及對照組給藥前后R1mRNA表達量及P物質含量比較差異均無統計學意義(P均>0.05)，給藥后治療組R1mRNA表達量及P物質含量均明顯低于給藥前及對照組(P均<0.05)。見表1。

圖4　對照組小鼠呼吸道上皮纖毛形態(×100 000)

圖5　對照組小鼠呼吸道上皮黏膜形態(×100 000)

圖6　對照組小鼠呼吸道上皮細胞透射電鏡表現(×100 000)

組別nVR1mRNA表達量給藥前給藥后P物質含量/(ng/mL)給藥前給藥后治療組100.82±0.120.35±0.08①②13.79±1.3610.23±2.26①②對照組100.83±0.110.85±0.1412.86±2.1113.42±2.59

注：①與給藥前比較，P<0.05；②與對照組比較，P<0.05。

2.32組給藥前后安全性指標比較2組小鼠給藥前后肝腎功能組內、組間比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表2。

表2　2組給藥前后安全性指標比較±s)

3討論

感染后咳嗽是常見的咳嗽病因之一。近年來多數學者認為本病主因是病毒感染后通過各種途徑損傷氣道上皮，導致諸如IL-4、IL-8、TNF-α等多種細胞因子浸潤以及刺激C神經纖維、破壞M受體導致膽堿能神經亢進，引起乙酰膽堿等遞質的釋放以及P物質增多，加之纖毛上皮受損并運動減弱，對各種刺激物的清除速度減慢，從而刺激咳嗽感受器引起咳嗽，但具體機制尚未完全明確[5-7]。目前西醫多以抗過敏、抗感染、霧化吸入β2受體激動劑以解痙平喘等療法為主[8-9]，治療效果不一，并且停藥后咳嗽容易反復，不少患者遷延難愈。

辣椒素受體廣泛分布于哺乳動物的中樞神經系統、心血管系統以及呼吸道、消化道上皮中，起初發現該受體主要與慢性疼痛密切相關[10]。近年國外研究證實VR1上調與慢性咳嗽直接相關[11]。葉新民等[3]研究發現，感染后咳嗽動物模型中肺組織VR1表達顯著上升，并且隨著時間的延長有上升趨勢。VR1激活后可刺激氣道黏膜的C類纖維，導致P物質等神經肽類物質釋放，引起神經源性炎癥反應及氣道高反應性并最終導致氣道重塑。因此拮抗VR1受體、拮抗P物質釋放有可能是治療感染后咳嗽的方向之一。但目前仍未有專門針對呼吸道VR1的拮抗劑或拮抗P物質藥物的相關報道。

感染后咳嗽屬于中醫學“外感咳嗽”范疇，一般分為風寒咳嗽、風熱咳嗽、風燥咳嗽幾個類型，臨床常用止嗽散、射干麻黃湯、杏蘇散等治療。筆者認為，感染后咳嗽患者多表現為咽癢、咽中刺激感，甚則如氣頂、氣往上沖之感，既有肺氣上逆的一般表現,更具風動、過敏、氣道攣急、喉癢逆嗆作咳的自身特征，正如清代高世試謂:“若喉癢而咳是火熱之氣上沖也，火越發而煙先起,煙氣沖喉,故癢而咳。”可見感染后咳嗽含有“火熱上攻”之基本病機，故若單純予疏風宣肺類方劑治療感染后咳嗽，似乎與病機未完全相合，其中醫治法尚應包含“清熱、緩急”的一面。從另一角度看，患者此時多以邪實之表現為主，故治療上如沒有明顯的正虛表現，可先予攻邪為主，是故邪去則正安，否則時間一長，變證迭出，病程更加纏綿。

加味升降散由僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃、百部、白前、甘草、杏仁、麻黃、厚樸、枳實、桑葉、牛蒡子組成，其中僵蠶、蟬蛻、姜黃、大黃為升降散原方，該方配伍精妙，四藥兩兩相伍，一升一降，具有解痙、通腑瀉熱之效，使邪毒得排，氣機得暢。現代藥理學研究表明，大黃、蟬蛻具有免疫抑制作用，姜黃、僵蠶具有良好的抗菌活性，四藥合用，具有抗炎、抗過敏、免疫抑制的復合療效。以此為基礎，合用枳實、厚樸加強下氣降逆之功；杏仁、麻黃、甘草為三拗湯，合百部、白前、桑葉共奏宣肺化痰、降氣鎮咳之效，使肺復宣降之職，邪有出路；牛蒡子瀉熱利咽，能直達病變部位，有引藥之用。諸藥合用，可奏宣肺清熱、祛痰下氣、緩急解痙之功，既無攻伐過當之虞，又有啟門逐寇之勢，更切合其中醫病機。現代醫學研究表明，甲流病毒是目前常見的感冒病毒之一，也是引起感染后咳嗽的常見病原體之一[12]。升降散能降低感染小鼠肺內病毒血凝滴度，具有良好的抑制病毒增殖的作用[13]。小樣本的臨床研究發現加味升降散對于感冒后咳嗽具有比較好的臨床療效[14]。本研究發現，治療組小鼠給藥后呼吸道上皮VR1mRNA表達量及肺內P物質含量均顯著低于對照組，而且治療組小鼠氣管黏膜上皮纖毛、微絨毛排列較對照組整齊，對照組不僅黏膜不完整，而且呼吸道上皮細胞粗面內質網嚴重腫脹，難以看到完整的細胞器。提示該方對小鼠氣道上皮有一定的修復作用。提示該方治療感染后咳嗽具有多靶點、多層次的特點，但該方誘導VR1下調的具體機制，是否存在量效關系以及時空效應，對于其他神經遞質如乙酰膽堿、肽類神經物質是否也具有抑制作用，這些都值得進一步研究。

[參考文獻]

[1]韋子章. 變態反應是喉源性咳嗽的重要病因[J]. 內蒙古中醫藥，2008，27(7)：62-63

[2]Lee LY. Respiratory sensations evoked by activation of bronchopulmonary C-fibers[J]. Respir Physiol Neurobiol，2009，167(1)：26-35

[3]葉新民，鐘南山，劉春麗，等. 呼吸道合胞病毒感染對豚鼠咳嗽相關氣道功能及其神經遞質的影響[J]. 國際呼吸雜志，2011,31(8)：571-575

[4]黃漢超. 加減升降散聯合西藥治療感冒后咳嗽臨床觀察[J]. 河北中醫，2012，34(10)：1511-1512

[5]王文，李飛俠，朱佳. 宣肺止嗽湯對感染后咳嗽大鼠肺泡灌洗液中細胞因子的影響[J]. 吉林中醫藥，2013,33(9)：934-936

[6]羅煒，張煦，林玲，等. 感染后咳嗽的氣道炎癥動態變化[J/CD]. 中華肺部疾病雜志：電子版，2014，7(5)：13-16

[7]田曼，葛傳生，麥根榮. 病毒感染引起氣道高反應性的神經-受體機制[J]. 中華結核和呼吸雜志,2002,25(1):45-47

[8]劉志文,盂東亮,王琦. 不同抗組胺藥治療感冒后咳嗽的療效比較[J]. 中國現代醫藥雜志,2008,10(9):74

[9]冷榮柏. 沙丁胺醇聯合酮替酚治療感冒后頑固性咳嗽102例療效觀察[J]. 西藏醫藥雜志,2009,30(1):7-8

[10] 駱昊，萬有，韓濟生. 辣椒素及其受體[J]. 生理科學進展，2003,34(1):11-15

[11] Morice AH，Geppetti P. Cough. 5: The type 1 vanilloid receptor:a sensory receptor for cough[J]. Thorax，2004，59(3)：257-258

[12] 張志強，劉剛，翟永志，等. 甲型H1N1流感病例513例分析[J]. 中國全科醫學，2012,13(2C)：577-579

[13] 李際強，張奉學，付林春，等. 升降散在體外抗甲型流感病毒的作用與對病毒血凝滴度的影響[J]. 中華中醫藥學刊，2003,21(2)：217-218

[14] 許建平,許少華. 止嗽散合升降散治療感染后咳嗽54例[J]. 福建中醫藥，2007,38(4)：37-38

Effect of compound Shengjiang powder on P substance content and VR1 expression in mouse respiratory epithelium after virus infection

HUANG Hanchao, CHEN Ning, ZHAO Haifang

(The Second Hospital of TCM of Guangdong Province, Guangzhou 510095, Guangdong, China)

Abstract:Objective It is to explore the effect of compound Shengjiang powder on P substance content and vanilloid receptor 1(VR1) expression in mouse respiratory epithelium after virus infection. Methods 40 SPF mice were randomly divided into experimental group and control group, the models were established by influenza A virus FM1 strains in both groups. The experimental group was treated with modified Shengjiang powder by gavage, and the controlled group was treated with distilled water, both groups were treated for 2 weeks. In 24 h after last gavage, the mice were killed and the pathological changes of their respiratory epithelium were observed by electron microscope, and the expression of VR1 mRNA were detected by PCR and the concentration of P substance from mice lung homogenate were measured by ELISA. Results In the treatment group, the concentration of P substance from mice lung homogenate and the expression of VR1 mRNA were lower than that in control group (P<0.05), and the respiratory epithelium also presented repaired tendency. Conclusion The modified Shengjiang powder has a good protective effect on the respiratory epithelium of mice virus infection.

Key words:modified Shengjiang powder；mice; vanilloid receptor 1；P substance; virus infection

[收稿日期]2015-09-16

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)01-0015-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.01.005

[基金項目]廣東省中醫藥局課題(20131107)

[作者簡介]黃漢超，男，副主任醫師，研究方向為中西醫結合急癥。