玉屏風散加味方干預COPD氣道重塑相關細胞因子作用研究

程　羽,陳　靜,羊忠山,張曉梅,袁嘉麗,陳　雨

(云南中醫學院,云南 昆明 650500)

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玉屏風散加味方干預COPD氣道重塑相關細胞因子作用研究

程羽,陳靜,羊忠山,張曉梅,袁嘉麗,陳雨

(云南中醫學院,云南 昆明 650500)

目的探討玉屏風散加味方對慢性阻塞性肺疾病(COPD)氣道重塑大鼠基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)、基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)和轉化生長因子β1(TGF-β1)的調節作用。方法將60只SD大鼠隨機分為正常組、模型組、玉屏風散加味方高劑量組、玉屏風散加味方中劑量組、玉屏風散加味方低劑量組、陽性組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠采用被動吸煙加氣管內注入LPS的方法復制COPD大鼠模型，玉屏風散加味方各組給予相應劑量玉屏風散加味方灌胃，陽性組給予羅紅霉素膠囊溶液灌胃，正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。灌胃30 d后用ELISA方法測定大鼠肺泡灌洗液中MMP-9、TIMP-1、TGF-β1水平，計算MMP-9/TIMP-1比值。結果模型組MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表達水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值明顯低于正常組(P<0.05)；玉屏風散加味方高、中劑量組及陽性組MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表達水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，玉屏風散加味方高劑量組MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表達水平均明顯低于玉屏風散加味方低劑量組(P均<0.05)。結論玉屏風散加味方可延緩COPD氣道重塑病變，其干預COPD氣道重塑的作用可能是通過調節氣道局部細胞因子MMP-9、TIMP-1和TGF-β1表達實現的，且以高劑量效果最為明顯。

[關鍵詞]玉屏風散加味方；慢性阻塞性肺疾病；氣道重塑；基質金屬蛋白酶-9；基質金屬蛋白酶抑制劑-1；轉化生長因子β1

基質金屬蛋白酶-9(MMP-9)存在于多種生物體并可表達于多種細胞，能調節降解氣道和細胞外基質(ECM)的代謝，其過度表達可使血管內皮生長因子釋放，促進新血管的形成，降解血管膠原成分，加速平滑肌細胞移行到血管基質，導致氣道重塑的發生發展[1]。基質金屬蛋白酶抑制劑-1(TIMP-1)能阻止或延緩酶原型MMP-9轉變為激活型MMP-9，減輕MMP-9參與血管內皮生長因子的釋放及上皮細胞的移行，從而阻止氣道平滑肌細胞肥厚增殖導致的氣道重塑[2]。TIMP-1以1∶1的分子比例與MMP-9異性結合形成復合物，從而特異性抑制MMP-9的活性，二者共同維持呼吸道壁破壞與修復間的平衡，參與支氣管、肺泡壁進行性破壞和不可逆的呼吸道重塑過程。轉化生長因子β1(TGF-β1)可以促進氣道平滑肌細胞增殖，使ECM成分合成，引起杯狀細胞增生，從而導致氣道內黏液分泌增多，刺激蛋白酶抑制劑的產生，從而引起ECM降解減少，沉積增加。有研究認為TGF-β1在肺內支氣管形態改變、細胞外基質產生和組織纖維化的過程中具有重要的作用[3]。基于此，本實驗試圖通過云南名中醫李慶生教授臨床治療慢性阻塞性肺疾病(COPD)有效方玉屏風散加味方干預COPD大鼠，探討該方對COPD病程關鍵環節氣道重塑相關因子MMP-9、TIMP-1和TGF-β1的調節作用，為中醫藥治療COPD提供臨床思路和實驗依據。現報道如下。

1實驗資料

1.1實驗動物SPF級SD大鼠60只，體質量(200±20 )g，由四川省達碩生物研究所提供(合格證號：0018160；許可證號：scxk(川)2014-23)。

1.2實驗材料及儀器脂多糖(LPS)，10 mg/支，臨用前與生理鹽水配制成0.1%溶液，置4 ℃冰箱保存備用；水合氯醛，臨用前與生理鹽水配置成10%的溶液；紅塔山牌香煙，MMP-9、TIMP-1及TGF-β1ELISA試劑盒(美國RB公司)，手術剪、眼科鑷、24G靜脈留置針、消毒巾。SPectraMax 340PC型酶標儀，超純水制備系統(Milli-Q BIOCEL)，-70 ℃超低溫冰箱(8525型)，YP型電子天平(上海光正醫療器械有限公司)，臺式高速離心機(美國BECKMAN公司)，自制有機玻璃煙熏箱(50 cm×30 cm×40 cm)。

1.3實驗用藥玉屏風散加味方組方：黃芪18 g、白術12 g、防風15 g、三七9 g、莪術12 g、桑白皮15 g、浙貝母15 g、白芥子15 g，每克生藥加水8 mL煎藥3次后取濾液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。以成人每日治療劑量根據大鼠體表面積換算為其等效劑量，此劑量作為中劑量實驗藥物，在此基礎上經過濃縮和稀釋獲得高、中、低劑量，低、中、高劑量的比例為1∶3∶9。陽性藥物制備方法：羅紅霉素膠囊按成人(60 kg)臨床每日用藥量即300 mg，每200 g大鼠1 d所需藥量=300 mg×0.018=5.4 mg(0.018是根據《中藥藥理實驗方法學》中人與大鼠按體表面積轉換系數)，碾碎研磨后用0.9%NaCl溶液配成濃度為5.4 mg/mL的溶液，置于4 ℃冰箱冷藏備用。

1.4實驗方法將大鼠隨機分為正常組、模型組、玉屏風散加味方高劑量組、玉屏風散加味方中劑量組、玉屏風散加味方低劑量組、陽性組，每組10只。除正常組外，其余各組大鼠采用被動吸煙加氣管內注入LPS的方法復制COPD大鼠模型[4]：實驗第1，14天腹腔注射10%水合氯醛麻醉后，固定于大鼠解剖臺上，暴露頸部，用碘消毒并用75%乙醇脫碘，按照大鼠頸部解剖位置，用1 mL注射器以水平方向15°斜刺進入氣管，回抽判斷是否刺入，氣管內注入LPS 200 μL，實驗第2—56天(注射LPS當天除外，造模成功后持續煙熏刺激28 d)上午將大鼠置入自制密閉的有機玻璃箱內，注入紅塔山牌香煙煙霧，每次被動吸煙4支，持續30 min/d。正常組采用相同的方法氣管內注入等量的生理鹽水，不予煙熏。造模28 d后，每組處死2只，各造模組可見支氣管管腔明顯狹窄，支氣管纖毛上皮細胞變性、壞死、脫落；支氣管周圍可見大量炎性細胞浸潤；肺泡結構紊亂，肺泡壁變薄或斷裂，肺泡腔擴大，融合成肺大泡。從第29天開始，玉屏風散加味方高、中、低劑量組及陽性組每日給予玉屏風散加味方及羅紅霉素膠囊溶液灌胃，按體質量每200 g灌胃2 mL，連續給藥28 d；正常組、模型組給予等量生理鹽水灌胃。

1.5標本采集及檢測方法末次灌胃后24 h，根據曾華東等[5]的實驗方法，收集大鼠支氣管肺泡灌洗液(BALF)。麻醉各組大鼠后將其置于大鼠手術臺，無菌條件下剪開腹腔進行腹主動脈取血，使頸部手術視野干凈，防止因出血模糊視野，用手術剪剪開頸部皮膚，鈍性分離，暴露出氣管和雙肺，將1根手術線從氣管下穿過，結扎右主支氣管，用24G靜脈穿刺針插入氣管內(注意不要超過氣管分叉處)針線結扎，將3 mL生理鹽水經留置針緩慢灌入氣道內，輕柔按摩肺臟30 s后，來回抽吸共行3次灌洗，用10 mL無菌離心管回收全部的BALF液(回收率>80%)，收集的BALF至于4 ℃ 4 000 r/min離心機離心20 min。離心后收集上清液，置-20 ℃冰箱保存待測。采用雙抗體夾心酶聯免疫吸附試驗(ELISA)檢測各組大鼠BALF中MMP-9、TIMP-1和TGF-β1表達水平，嚴格按照試劑盒說明書操作，用酶標儀在450 nm波長下測定吸光度，計算樣品濃度。

2結果

模型組MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表達水平均明顯高于正常組(P均<0.05)，MMP-9/TIMP-1比值明顯低于正常組(P<0.05)；玉屏風散加味方高、中劑量組及陽性組MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表達水平均明顯低于模型組(P均<0.05)，玉屏風散加味方低劑量組MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表達水平與模型組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)；玉屏風散加味方高劑量組MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表達水平均明顯低于玉屏風散加味方低劑量組(P均<0.05)，玉屏風散加味方中劑量組MMP-9、TIMP-1、TGF-β1表達水平與低劑量和高劑量組比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

3討論

COPD屬于中醫學“咳嗽”“喘證”“肺脹”等范疇，中醫學認為“肺氣虛兼痰瘀”是COPD的基本病機[6-7]。氣虛是肺脹的發病基礎，亦是COPD氣道重塑發生發展的根基。因此，玉屏風散加味方以黃芪、白術為君藥。黃芪善入肺經，補益肺、脾之氣，脾氣健運則津液得布，痰濁自除。白術功善健脾，能培土生金，與黃芪配伍補益肺氣之功愈強；又能燥濕有助于脾氣運化，杜絕生痰之源，祛除痰濁。防風走表而散風御邪，黃芪得防風則補肺不留邪。瘀血與痰阻是COPD氣道重塑進程中非常重要的環節，在疾病發生發展中既是病因，又是病理產物。故用三七、莪術活血逐瘀，為臣藥。三七善入血分，長于化瘀生新，有化瘀不傷正、止血不留瘀的特點。莪術既入血分又入氣分，能破血散瘀，二者協同增效，逐瘀力強，與黃芪、白術同用，行血不傷血，祛瘀不傷正。同時，以桑白皮、浙貝母、白芥子宣肺降氣平喘滌痰為佐藥。桑白皮能泄肺中水氣而平喘，亦能降泄肺氣，通調水道，祛除痰濁；浙貝母長于清熱滌痰，降泄肺氣；白芥子消皮里膜外之痰。三藥相配伍，寒溫并用，潤燥相結合，有助于痰濁祛除。

表1　各組大鼠細胞因子MMP-9、TIMP-1、MMP-9/TIMP-1、TGF-β1表達水平比較

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05；③與玉屏風散加味方低劑量組比較，P<0.05。

COPD氣道重塑早期肺組織以MMP-9的表達增加為主，主要存在于滲出的中性粒細胞(NEU)、肺泡巨噬細胞(AM)和支氣管上皮細胞中。MMP-9 除了通過破壞ECM，還破壞肺泡上皮結構，參與炎性反應和氣道重塑[8]。炎癥反應促使MMP-9 表達增強，MMP-9可使基底膜成分降解，介導單核細胞等穿過血管，在降解的ECM中游走，向靶器官浸潤，促進炎癥反應及組織損傷，并促使肺泡壁基底膜降解及肺氣腫形成。本實驗結果表明，正常組大鼠BALF中MMP-9表達水平極少，模型組MMP-9表達水平明顯升高，提示MMP-9參與了COPD氣道重塑的病變過程。經玉屏風散加味方治療后MMP-9表達水平下調，尤其以高劑量組的表達水平下調明顯，推測玉屏風散加味方通過活血、化瘀等作用抑制MMP-9過高的表達，從而抵抗肺組織纖維化。

TIMP-1 在TIMPs所有亞類中活性最強，它主要由AM、內皮細胞、成纖維細胞合成，并以可溶性的形式分泌到ECM中。TIMP-1以1∶1的分子比例與MMP-9特異性結合形成復合物，從而特異性抑制MMP-9的活性，共同維持呼吸道壁破壞與修復間的平衡，參與支氣管、肺泡壁進行性破壞和不可逆的氣道重塑構過程。

本實驗結果表明，正常組大鼠BALF中TIMP-1表達水平極少，模型組TIMP-1表達水平明顯升高，提示COPD氣道重塑炎癥發生時TIMP-1表達水平升高，且參與COPD的疾病過程。經玉屏風散加味方治療后TIMP-1表達水平下調，尤其以高劑量組的下調最為明顯，表明玉屏風散加味方可下調COPD模型大鼠氣道重塑的TIMP-1表達水平。

MMP-9和TIMP-1間的平衡是維持ECM正常狀態所必需的，一旦平衡打破即出現病理狀態。MMP-9/TIMP-1比值升高，表明氣道以炎癥反應為主，將導致組織破壞；MMP-9/TIMP-1比值下降，則表明氣道以修復為主，將導致組織纖維化。氣道重塑是機體對呼吸道炎癥損傷過程的一種修復反應，是氣道反復炎癥損傷與修復的結果。畢麗鑫[9]研究發現COPD大鼠BALF中MMP-9和TIMP-1表達水平在肺組織中隨造模時間延長而逐漸增高，說明MMP-9和TIMP-1在COPD合并肺間質纖維化中起著重要作用，MMP-9/TIMP-1比值逐漸下降，說明TIMP-1增高在致纖維化作用中起重要作用。本研究結果表明，模型組MMP-9/TIMP-1比值明顯低于正常組(P<0.05)，表明模型組存在MMP-9/TIMP-1平衡失調，且以TIMP-1表達水平升高更顯著，其在抑制MMP-9活性的同時也引起了膠原的過度沉積，氣道以修復為主可能出現氣道壁向纖維化發展，最終導致氣道重塑。值得注意的是經玉屏風散加味方治療后大鼠MMP-9/TIMP-1比值與模型組比較差異不明顯，提示當COPD出現氣道重塑病變時，其病程可能已進入到不可逆的階段。

TGF-β1為AM分泌的一種細胞因子。Crosby等[10]實驗發現，當大鼠出現肺纖維化時，其TGF-β1含量增加，高于無支氣管病變大鼠,表明通過拮抗TGF-β1可能會減輕氣道重塑。TGF-β1是一種多效性的細胞因子，參與了COPD的多種病理過程。在COPD中被激活的AM釋放TGF-β1可促使小氣道平滑肌的增殖以及ECM合成，導致氣道重塑。TGF-β1在細胞的生長、分化、免疫調節、炎癥和損傷修復等方面發揮重要的作用[11]。本實驗結果表明模型組大鼠TGF-β1表達水平升高，提示TGF-β1參與了COPD氣道重塑。經玉屏風散加味方治療后可下調TGF-β1表達水平，尤以高劑量組的下調最為明顯，推測玉屏風散加味方可能通過滌痰逐瘀、活血化瘀等作用調節TGF-β1表達水平。

總之，TIMP-1是MMP-9的抑制劑，TIMP-1可以下調MMP-9酶原的激活，抑制已活化MMP-9酶活性來抑制MMP-9的生物學活性[12]。本實驗結果表明當MMP-9表達升高時，TIMP-1和TGF-β1表達也隨之升高，三者均參與了COPD氣道重塑，且模型組MMP-9/TIMP-1比值明顯低于正常組，表明當TIMP-1表達水平升高大于MMP-9升高時，氣道發生纖維化。因此，在COPD防治策略中，應該充分考慮并兼顧三者之間的相互聯系。另外，本實驗對玉屏風散加味方不同濃度劑量的藥效進行研究，發現高劑量下調MMP-9、TIMP-1、TGF-β1的作用尤為明顯，可為臨床治療COPD提供一些思路。

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Study on the effect of Yupingfeng powder on the airway remodeling related cytokines in COPD patients

CHENG Yu, CHEN Jing, YANG Zhongshan, ZHANG Xiaomei, YUAN Jiali, CHEN Yu

(Yunnan College of Traditional Chinese Medicine, Kunming 650500, Yunnan, China)

Abstract:Objective It is to explore the regulating effect of Yupingfeng powder on MMP-9, TIMP-1 and TGF-β1 in COPD rats with airway remodeling. Methods 60 SD rats were randomly divided into normal group, model group, high, medium and low dose of Yupingfeng powder groups, positive group, each group had 10 rats. All the rats except in normal group were given passive smoking with LPS injected in airway to establish COPD model. The Yupingfeng powder groups were given Yupingfeng powder at the respective dose by gavage, the positive group was given erythromycin capsule solution by gavage, normal group and model group was given normal saline by gavage. After treating for 30 days, the levels of MMP-9, TIMP-1, TGF-β1 in bronchoalveolar lavage fluid of the rats were determined by ELISA, and MMP-9/TIMP-1 were calculated. Results The levels of MMP-9, TIMP-1, TGF-β1 in model group were significantly higher while MMP-9/TIMP-1 were lower than that in normal group (P<0.05), the levels in high and medium dose of Yupingfeng power groups and positive group were significantly lower than that in model group (P<0.05), the levels in high dose of Yupingfeng power group were lower than that in lower dose of Yupingfeng power group(P<0.05). Conclusion Yupingfeng powder can delay the development of airway remodeling induced by COPD, and the intervention mechanism may be achieved by regulating airway remodeling related cytokines MMP-9, TIMP-1, TGF-β1, and the effect is most significant in high dose group.

Key words:Yupingfeng powder; COPD; airway remodeling; MMP-9;TIMP-1; TGF-β1

[收稿日期]2015-03-15

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)01-0007-04

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.01.003

[基金項目]云南省科技廳基礎研究重點項目(2013FA041)；云南省應用基礎研究項目(2015FB194)

[作者簡介]程羽，男， 博士， 講師， 研究方向為中西醫結合基礎。[通信作者]袁嘉麗， E-mail：YJL6688767@sina.com