非小細胞肺癌組織中BRCA1和MDM2表達意義

葛　華，丁　敏，王　虹，王　秦，李長江，張美英,4，王建英,4

(1. 中煤一公司嶺北職工醫院，河北 邯鄲 056003,2. 河北工程大學，河北 邯鄲 056001，3. 河北省邯鋼職工醫院，河北 邯鄲 056000;4. 河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001)

?

臨床研究

非小細胞肺癌組織中BRCA1和MDM2表達意義

葛華1，丁敏2，王虹3，王秦1，李長江1，張美英1,4，王建英1,4

(1. 中煤一公司嶺北職工醫院，河北 邯鄲 056003,2. 河北工程大學，河北 邯鄲 056001，3. 河北省邯鋼職工醫院，河北 邯鄲 056000;4. 河北省邯鄲市中心醫院，河北 邯鄲 056001)

[摘要]目的探討非小細胞肺癌(non-small cell lung cancer，NSCLC)組織中乳腺癌易感基因(BRCA1)和鼠雙微體基因2(MDM2)的表達情況及臨床意義。方法收集NSCLC組織標本48例和癌旁組織20例，采用免疫組化SP法檢測各組中BRCA1和MDM2的表達，分析 BRCA1 與臨床病理指標及MDM2的關系。結果NSCLC組織中BRCA1異常表達和MDM2陽性率明顯高于癌旁組織(P<0.05)；BRCA1異常表達與NSCLC的腫瘤分期(TNM)、有無淋巴結轉移相關(P均<0.05)，與年齡、性別、組織類型、分化程度無顯著性相關(P均>0.05)。MDM2陽性表達與NSCLC的分化程度、腫瘤分期(TNM)、有無淋巴結轉移相關(P均<0.05)，與年齡、性別無顯著性相關(P均>0.05)。 相關性分析得出BRCA1和MDM2的表達存在顯著相關性(P<0.05)。結論BRCA1和MDM2在NSCLC發生和轉移中可能起重要作用，BRCA1和MDM2與NSCLC的浸潤轉移密切相關，可作為預后的判斷指標。

[關鍵詞]非小細胞肺癌；BRCA1蛋白；MDM2蛋白；免疫組織化學

在我國肺癌發病率和死亡率一直呈上升趨勢，是目前威脅我國居民生命和健康的重要疾病之一，由于多數肺癌患者確診時已是中晚期，放射治療成為主要的治療手段之一，這也是肺癌總生存率低的主要原因。乳腺癌易感基因(BRCA1)在乳腺癌、宮頸癌、卵巢癌等組織中研究較多，屬于和女性腫瘤相關的易感基因，在女性腫瘤組織中研究較多。鼠雙微染色體2(MDM2)生物學功能是干預細胞生長，參與到組織細胞生長抑制、凋亡、細胞周期調控等過程，能在促進腫瘤細胞生長與增殖方面發揮作用。目前BRCA1及MDM2在肺癌中表達情況的報道少見。本研究通過免疫組織化學SP法檢測BRCA1及MDM2在NSCLC組織中的表達情況，分析其在NSCLC的發展和轉移中的作用，以期幫助臨床對NSCLC的早期診斷和治療提高依據和理論支持，并產生一定的社會效益和經濟價值。

1臨床資料

1.1一般資料選取NSCLC標本48例作為NSCLC組，男36例，女12例;年齡31～75歲，中位年齡57.21歲，其中>50歲40例，≤50歲8例；腫瘤高分化22例，中分化23例，低分化3例；肺鱗癌36例，肺腺癌9例，大細胞癌3例；TNM分期Ⅰa期5例、Ⅰb 期9例、Ⅱa期10例、Ⅱb期6例、 Ⅲa期7例、Ⅲb期9例、Ⅳ期2例；伴有淋巴結轉移31例,無淋巴結轉移17例。選取取自腫瘤遠端3 cm 以外或手術切緣經病理檢查證實未發現癌細胞正常組織作為對照組。

1.2方法BRCA1和MDM2表達檢測采用SP免疫組化法，按試劑盒說明書操作，取已知乳腺癌組織切片作為陽性對照，以PBS緩沖液代替一抗作為陰性對照。具體操作步驟為：常規切片處理后，進行內源性過氧化物酶滅活，加雙氧水孵育10 min，PBS緩沖液沖洗3次；進行抗原修復，把切片放入枸櫞酸鈉緩沖液中煮沸(95 ℃)孵育15～20 min，自然冷卻后PBS緩沖液沖洗3次；正常血清工作液封閉10 min，傾去勿洗；滴加一抗4 ℃過夜，PBS緩沖液沖洗3次，滴加生物素標記，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3次；滴加辣根過氧化物酶工作液，37 ℃孵育30 min，PBS緩沖液沖洗3次；DAB反應顯色，自來水沖洗；蘇木素復染，常規脫水、透明、干燥、封片。鏡下觀察以每張切片均隨機觀察5個高倍視野(×400)，陽性細胞數<5%為(-)，5%～25%為(+)，26%～50%為()，>50%為()。+～為陽性表達。

1.3統計學方法采用SPSS 12.0統計軟件，計數資料采用2檢驗。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.12組BRCA1陽性率比較NSCLC組和對照組BRCA1陽性率分別為58%(28/48)、35%(7/20),MDM2陽性率分別為81%(39/48)和25%(5/20)。2組比較差異均有統計學意義(P均<0.05)。

2.2NSCLC不同臨床病理參數BRCA1和MDM2陽性表達情況比較TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者的BRCA1陽性率顯著低于Ⅲ+Ⅳ期(P<0.05)，有淋巴結轉移者BRCA1陽性率顯著高于無淋巴結轉移者(P<0.05)，高分化者MDM2陽性率顯著高于中分化者(P<0.05)，TNM分期Ⅰ+Ⅱ期患者MDM2陽性率顯著高于Ⅲ+Ⅳ期(P<0.05)，有淋巴結轉移者MDM2陽性率顯著高于無淋巴結轉移患者(P<0.05)。見表1。

表1　NSCLC不同臨床病理參數BRCA1和MDM2

2.3NSCLC患者中BRCA1和MDM2蛋白相關性BRCA1和MDM2蛋白表達具有明顯相關性(r=0.460,P<0.05)。見表2。

表2　BRCA1和MDM2表達的相關性　例

3討論

同大多數腫瘤一樣，NSCLC的形成過程包括癌基因的激活、抑癌基因的失活、細胞的凋亡、異常增生、DNA損傷修復的缺失異常等。隨著對NSCLC生物學治療的重視，從基礎水平對NSCLC進行研究也越來越受到追捧。

BRCAl基因是迄今發現的與乳腺癌發生、發展密切相關、重要的、經典的易感基因，在臨床應用較普遍，如在宮頸癌[1]、卵巢癌[2]等婦科腫瘤組織中發現其明顯增高，且受到國內外專家學者的重視。BRCA1 基因全長 100 kb，定位于人染色體 17q12—21，參與調節細胞周期、DNA 損傷的修復、細胞生長與凋亡等多種生物學途徑[3]，被認為是基因組的看護者，在 DNA 修復中起重要作用，維持基因組的完整[4]，當 BRCA1 基因發生突變后，使其編碼的蛋白質功能降低或者缺失，使細胞分化受阻，失去正常分化對增殖的作用，從而導致細胞惡變和惡性腫瘤的發生[5]。BRCA1 蛋白在人的多數組織中也有不同程度的表達，在胸腺、睪丸中表達最高，乳腺和卵巢中表達中等，通過大量實驗結果表明在許多腫瘤中存在著 BRCA1 蛋白的異常高表達，這種異常高表達稱為基因突變，BRCA1 異常表達與惡性腫瘤的發生、發展及預后有著密切的關系[6]。另外臨床研究發現此基因失活的腫瘤對順鉑相對敏感，認為BRCA1 的高表達使細胞修復能力增強，從而使細胞不易被化療藥物殺死，導致耐藥[7]。本研究發現BRCA1蛋白在NSCLC中的呈異常表達，在有淋巴結轉移、腫瘤TNM分期較差的NSCLC組織中BRCA1異常表達增高，可見其異常表達在NSCLC的發生、發展起到促進作用；而其與NSCLC患者的年齡、性別、組織類型、分化程度沒有明顯相關性， 考慮到在NSCLC組織中BRCA1異常表達情況及對順鉑的敏感性，BRCA1檢測值得在有條件的臨床上推廣。

癌基因MDM2于1987年被發現[8]，其作為原癌基因在正常組織中含量非常少，但是在組織內發生突變或者異常表達時引起多種腫瘤的發生，如肝癌、食管癌、胃癌[9-11]等。這些調控作用通過調節細胞周期G1期進入S期來完成的，通過MDM2可以激活E2F-1，E2F-1正常情況下與口袋蛋白(Rb)結合保持穩定性，被激活后E2F-1蛋白與Rb蛋白分離，促使細胞周期G1期進入S期。G1期進入S期對于細胞周期的運行和完成是至關重要[12]，所以說高表達MDM2表現出癌基因的功能，MDM2通過調節E2F-1對細胞周期進行調控，形成正反饋環。許多研究表明在大腸癌、乳腺癌[13-14]等中能檢測到MDM2表達增加、失調，本研究與之一致，并且其表達能力與腫瘤轉移及浸潤情況有密切相關性，提示腫瘤與 MDM2 的預后有密切的關系。本研究的48例NSCLC組織中有39例癌基因MDM2陽性表達，并且發現其在NSCLC組織中的表達隨組織學分化程度增高陽性表達率增高，并與淋巴結有無轉移、腫瘤TNM分期有明顯差異性，而與患者年齡、性別、吸煙史及病理類型之間無顯著性差異，說明在NSCLC組織中癌基因MDM2表達越高腫瘤的惡性度越高。

在對NSCLC中BRCA1和MDM2異常表達的研究發現，兩者在NSCLC組中表達呈正相關。它們在腫瘤發生、發展中應該存在一定的聯系，兩者都作用于細胞周期G1—S期，BRCA1發生磷酸化異常表達，而MDM2對細胞周期的調控作用點恰恰是這一點，兩者共同促進細胞周期G1期進入S期，共同對NSCLC發生和發展起促進作用。另外，考慮到在臨床上腫瘤化療時，可以用BRCA1作為耐藥判斷指標，BRCA1具有一定的實用價值，故應該對其深入開展研究。

[參考文獻]

[1]聆風. BRCAI基因能阻斷兩種性激素—BRCAI基因突變女性易息乳腺癌,宮頸癌和子宮內膜癌得到解釋英國研究人員發現,BRCAI基因[J]. 中華醫學信息導報,2006,21(4):10

[2]杜培,王沂峰,張曉薇,等. TP/TC 方案新輔助化療對原發性上皮性卵巢癌ER-CC1、BRCA1及β-tubulinⅢ表達的影響[J]. 現代婦產科進展,2014,23(12)：955-958(963)

[3]Seully R,Livingston DM. Insearch of the tumour-suppressor functions of BRCA1 and BRCA2[J]. Nature,2000,408(611):429-432

[4]許奕. BRCA1的研究進展[J]. 北京醫學,2005,27(1):50-52

[5]曾薇,單利,帕提古麗,等. BRCA1表達與術后非小細胞肺癌化療及預后關系的研究[J]. 臨床腫瘤學雜志,2010,15(12):1070-1073

[6]陳芹,周彩存,張頡,等. ERCC1、RRM1和BRCA1在非小細胞肺癌中的表達及預后意義[J]. 腫瘤,2007,27(9):719-722

[7]Fong KM,Sekido Y,Gazdar AF,et al. Lung cancer.9:Molecular biology of lung cancer:clinical implications[J]. Thorax,2003,58(10):892-900

[8]王勁歐,呂慶杰,曹薇,等. ER和MDM2及ERK1/2信號通路與卵巢癌耐藥關系的研究[J]. 中華腫瘤防治雜志,2008,15(19):1457-1461

[9]褚曉磊,吳永平,柳紅,等. 肝細胞性肝癌中Hep27和MDM2蛋白的表達及意義[J]. 臨床與實驗病理學雜志,2011,27(9):1002-1004

[10] 李超霞,方力,楊小紅. MDM2、P53和P27蛋白在食管鱗癌及其癌旁組織中表達及其意義[J]. 癌變畸變突變,2009,21(5):362-366

[11] 鄧學田,齊文秀,鍋紅芬. pl4ARF、mdm2、p53基因蛋白表達與胃癌相關性及聯合診斷價值分析[J]. 疑難病雜志,2009,13(6):622-624

[12] Blagosklonny MV,Pardee AB. The restriction point of the cell cycle[J]. Cell Cycle,2002,1(2):103-110

[13] 張珊珊,黎麗旋,黃載偉,等. 基因芯片技術篩選和鑒定CD133+CD200+大腸癌干細胞相關基因[J]. 南方醫科大學學報,2013,33(12):1787-1791

[14] 關舒,曹彧,王玉穎,等. p53與MDM2基因多態性和東北女性乳腺癌發病風險的相關性研究[J]. 中國醫科大學學報,2014,43(3):205-208

[收稿日期]2015-06-18

[中圖分類號]R734.2

[文獻標識碼]B

[文章編號]1008-8849(2016)06-0607-03

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.06.011

[基金項目]河北省邯鄲市科技計劃項目(1423108134)