芪參養肝方抗肝纖維化的實驗研究

徐莉英，高月求，周振華

(1. 上海市黃浦區傳染病醫院，上海 200011；2. 上海曙光醫院，上海 201203)

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芪參養肝方抗肝纖維化的實驗研究

徐莉英1，高月求2，周振華2

(1. 上海市黃浦區傳染病醫院，上海 200011；2. 上海曙光醫院，上海 201203)

[摘要]目的觀察芪參養肝方對刀豆蛋白A(ConA)肝纖維化小鼠肝臟的肝星狀細胞(HSC)活化、膠原合成及細胞因子α-SMA、TGF-β1分泌的影響，探討其抗肝纖維化的作用機制。方法將40 只BALB/c小鼠隨機分為正常組、模型組、芪參養肝方組，造模期間芪參養肝方組給予芪參養肝方藥液灌胃。檢測3組小鼠肝功能、肝組織中羥脯氨酸含量和α-SMA、Col I、ColⅢ、TGF-β1 mRNA表達以及α-SMA、Col I、TGF-β1蛋白表達情況。結果模型組血清ALT、AST水平及肝組織中羥脯氨酸含量均明顯高于正常組(P均<0.05)，而芪參養肝方組各指標水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。HE、天狼猩紅染色顯示，芪參養肝方組肝小葉破壞及膠原纖維增生較模型組明顯減輕，膠原沉積明顯好轉。模型組肝組織中α-SMA、TGF-β1、Col I、ColⅢ mRNA表達量及α-SMA、TGF-β1、ColⅠ蛋白表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，而芪參養肝方組各指標水平均明顯低于模型組(P均<0.05)。結論芪參養肝方能抑制ConA肝纖維化小鼠α-SMA、TGF-β1分泌及HSC活化，促進活化的HSC凋亡；并能下調ColⅠ、Col Ⅲ mRNA表達，抑制膠原纖維增生；其有保肝降酶、抗肝纖維化作用。

[關鍵詞]芪參養肝方；刀豆蛋白；肝纖維化

肝纖維化是多種慢性肝病發展的共同病理基礎，其實質是以膠原為主的細胞外基質(ECM)的合成大于降解，過多的ECM沉積在肝臟中，最終形成肝纖維化。大量的臨床研究證實肝纖維化完全有可能發生逆轉，但目前國內外尚無理想的抗肝纖維化藥物，而中醫中藥在抗肝纖維化的治療中優勢明顯。中醫認為肝病日久，氣陰虧損，血行不利，脈絡瘀阻，而芪參養肝方有益氣養陰、活血化瘀、軟堅散結之功效，緊扣肝纖維化的病機特點，故本研究觀察了芪參養肝方對刀豆蛋白A(ConA)誘導的肝纖維化小鼠肝臟的HSC活化、膠原合成、細胞因子α-SMA、TGF-β1分泌的影響，旨在探討芪參養肝方抗肝纖維化的作用機制。

1實驗資料

1.1實驗動物BALB/c小鼠，雄性，體質量18～23 g，由上海中醫藥大學實驗動物中心提供，動物合格證號：SCXK(滬)2008-0016。實驗動物用標準飼料喂養，常規飼養觀察1周后使用。

1.2藥物與主要試劑芪參養肝方實驗用藥由芪參養肝膠囊溶解所得，由黃芪、鱉甲、丹參、靈芝、赤芍、五味子、白術、陳皮、柴胡組成，北京華神制藥有限公司提供。去除膠囊外殼，將粉末溶于雙蒸水，配成0.1 g/mL的藥液，冷藏備用。ConA：Ⅵ型， SIGMA公司(C2010)，用時配成1.25 mg/mL，用過濾器過濾，現配現用。

1.3實驗方法將40 只小鼠隨機分為正常組(8只)、模型組(16只)、芪參養肝方組(16只)。模型組和芪參養肝方組給予ConA 12.5 mg/kg尾靜脈注射造模，每周1次，連續10周，正常組則相應給予生理鹽水尾靜脈注射。3組均給予正常飼料喂養，正常組和模型造模當天按1 mL/100 g小鼠體質量灌胃雙蒸水，每日1次，共10周；芪參養肝方組造模當天按1 mL/100 g小鼠體質量灌胃芪參養肝方藥液，每日1次，共10周。

1.4觀察指標

1.4.1小鼠肝功能指標3組小鼠均于末次灌胃后24 h取血，全血置于1.5 mL EP管，靜置2 h，3 000 r/min離心15 min，吸取血清，自動生化分析儀檢測肝功能指標丙氨酸氨基轉移酶(ALT)、天門冬氨基酸氨基轉移酶(AST)、白蛋白(ALB)。

1.4.2小鼠肝組織中羥脯氨酸(Hyp)含量按南京建成生物工程研究所提供的Hyp測定試劑盒說明書操作：稱取新鮮肝組織100 mg剪碎，置于試管中，準確加水解液1 mL，混勻。加蓋后95 ℃中水解20 min(為使水解更充分，10 min混勻1次)；調節pH值至6.0～7.0：①各試管流水冷卻后分別加指示劑1滴，混勻；②各試管內準確加入調pH甲液1 mL，混勻(此時溶液應為紅色)；③試管內逐滴加入調pH乙液，每滴加入后均需混勻，直至液體中的指示劑變成黃綠色，此時pH值6.0～7.0；加蒸餾水至10 mL，混勻；取3～4 mL稀釋的水解液加適量活性炭(20～30 mg)，以上清液離心后澄清無色為準，混勻，4 000 r/min離心10 min，取上清液1 mL做檢測。計算公式：Hyp含量=(測定管吸光度-空白管吸光度)/(標準管吸光度-空白管吸光度) ×標準管含量(5 μg/mL)×水解液總體積(10 mL)/組織濕質量(mg)。

1.4.3小鼠肝組織病理切片染色取新鮮肝臟，清潔后稱取肝質量，從肝右葉取1塊肝組織，石蠟包埋，做HE、天狼猩紅染色。在光鏡下觀察組織切片的病理變化：ColⅠ纖維緊密排列，為黃色或紅色的粗大纖維；ColⅢ纖維為綠色的細纖維。攝片取四周及中央區域膠原纖維含量最多的視野，每個視野含一個匯管區。采用HIPAS-2000型計算機圖像分析系統，通過顯微攝影系統攝取圖像并輸入圖像分析系統進行灰度轉換，使膠原著色區域與背景分開，記錄著色面積和總面積。在200倍鏡下測定膠原纖維面積，計算膠原定量：膠原纖維面積/肝組織面積×100%，取平均值。

1.4.4小鼠肝組織中α-SMA、ColⅠ、ColⅢ、TGF-β1mRNA表達量采用RT-PCR法測定。①取液氮罐超低溫冰箱保存肝臟組織，選用美國Invitrogen公司trizol，按照說明操作提取總RNA。②總RNA濃度測定：取1 μL滅菌純水，置于RNA濃度測定儀器測定孔，儀器調零；各組總RNA分別取1 μL，加于測定孔，讀取RNA濃度及OD260/OD280的比值。OD260/OD280值1.8～2.1說明RNA純度好；<1.8表明溶液中蛋白或其他有機物污染，>2.1表明RNA已經降解為單核酸。③引物設計與合成 ：從NCBI上查得基因序列,用oligo和primer5設計引物,設計好的引物由invitrogen公司合成。④反轉錄反應： 按照Ferments試劑盒(#K1621)操作。⑤PCR擴增反應。⑥結果分析：根據2-△△CT法，以GAPDH為參照，進行OPN基于表達的相對定量分析。

1.4.5小鼠肝組織中α-SMA、ColI、TGF-β1蛋白表達量采用Western Blot法測定。①提取總蛋白： 從-80 ℃冰箱取出肝組織，剪取一小塊(30～50 mg)放入1.5 mL EP管，加入100 μL含1%PMSF的細胞裂解液，用小剪刀將其剪碎。冰上放置30 min使樣品裂解充分，14 000 g 4 ℃離心5 min，取上清。②BCA法測定蛋白濃度： 按照試劑盒說明操作，根據讀數做出標準曲線，計算各樣品濃度。③制樣： 每份樣品上樣總質量為20 μg，上樣總體積為10 μL(其中含上樣緩沖液2 μL)，根據所測蛋白樣品濃度，計算樣品所需體積，余用0.9%NaCl補足。④制膠： 根據所測蛋白分子量，分別配制10%分離膠和5%濃縮膠灌分離膠，以蒸餾水水封，待凝膠后，將蒸餾水倒去，用濾紙吸干，灌入濃縮膠，插入10孔上樣梳，注意避免氣泡。⑤上樣、電泳：將膠板置于電泳槽，加入電泳液。樣品于100 ℃水浴煮沸5 min，依次上樣，并留取一孔加入分子量標準。電泳時，起始電壓為80 V，待樣品進入分離膠后，將電壓調至110 V。⑥半干法轉膜：以分子量標準為參照，切取所需轉膜部分分離膠，標記右上角，浸入轉膜液(4 ℃預冷)中平衡15～30 min。分別切取與分離膠大小相似的PVDF膜1張及濾紙2張，膜標記右上角。將膜浸于甲醇中平衡1 min，與濾紙一并浸于轉膜液中平衡15～30 min。從下而上，依次將濾紙、膜、分離膠、濾紙置于半干法轉膜儀上，注意用玻璃棒排除其中氣泡。蓋上電轉儀蓋子，接通電源，根據所轉蛋白分子量，室溫、25 V恒壓電轉10～30 min。⑦封閉:將膜置于平皿，加入適量封閉液，置于搖床上，室溫封閉2 h。⑧抗體孵育:從封閉液中取出膜，于TBST洗膜液中漂洗3 min。將膜放入雜交袋中，加入適量經稀釋的一抗(1∶1 000～1∶500)，封口，搖床上4 ℃孵育，過夜。取出膜，進入TBST洗膜液中漂洗3次，每次10 min，換另一雜交袋，加入二抗(1∶1 000)，搖床上室溫孵育2 h。取出膜，繼續用TBST洗膜3次，每次10 min。⑨顯影:打開顯影暗夾，鋪一層保鮮膜，PVDF膜正面朝上放于保鮮膜上，按說明要求將ECL Plus A液和B液1∶1混合，滴于PVDF膜上，靜置3 min，吸去多余液體，蓋上保鮮膜，排除氣泡，移入暗室顯影。取出1張X射線膠片，放于條帶上面，輕輕蓋上暗夾蓋，注意防止膠片滑動。根據條帶發光的強度，壓片10 s～1 min，打開蓋子，取出膠片，放入顯影液顯影，再用清水漂洗下，移入定影液中定影，最后清水漂洗，晾干。⑩圖像分析：將膠片條帶用圖像掃描儀掃描入電腦，用圖像分析軟件對條帶進行分析，以目的蛋白與內參蛋白灰度值的比值作為相對值，比較各樣品間蛋白表達的差異性。

1.5統計學方法所有資料采用SPSS 15.0統計軟件進行統計學分析。計量資料用均數±標準差表示，組間比較采用單因素方差分析，多重比較采用LSD法，率的比較用2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2結果

2.13組小鼠肝功能比較模型組小鼠血清ALT、AST水平明顯高于正常組(P均<0.05)；芪參養肝方組血清ALT、AST水平明顯低于模型組(P均<0.05)；3組ALB水平比較差異均無統計學意義(P均>0.05)。見表1。

表1　3組小鼠肝功能比較±s)

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.23組小鼠肝組織中Hyp含量比較正常組肝組織中Hyp含量為(58.7±7.2)μg/mg，模型組為(120.3±15.3)μg/mg，芪參養肝方組為(92.2±9.7)μg/mg。模型組Hyp含量明顯高于正常組(P<0.05)，芪參養肝方組明顯低于模型組(P<0.05)。

2.33組小鼠肝組織病理表現

2.3.1HE染色鏡下可見正常組小鼠肝細胞肝小葉結構完整，肝索以中央靜脈為中心，放射狀排列整齊，未見炎性細胞浸潤；模型組小鼠肝細胞可見正常肝小葉結構破壞，肝索排列紊亂，鏡下可見程度不一的肝細胞壞死區，可見大量炎性細胞浸潤；與模型組比較，芪參養肝方組小鼠肝細胞肝小葉結構破壞明顯減輕，肝索排列相對整齊，僅在匯管區見少量炎癥細胞浸潤。見圖1～3。

2.3.2天狼猩紅染色鏡下可見正常組小鼠肝小葉結構完整，肝細胞索排列整齊，僅于匯管區血管周圍有少量膠原纖維染色，未見明顯膠原增生。模型組小鼠肝組織中膠原明顯增生，膠原纖維沿匯管區或炎性壞死區向外延伸，形成厚度不一的纖維間隔，多位于匯管區和血管周圍。芪參養肝方組與模型組比較，膠原纖維增生明顯減少，纖維化程度有明顯好轉。見圖4～6。天狼猩紅染色膠原定量：正常組膠原指數(0.23±0.01)%，模型組膠原指數(9.37±0.73)%，芪參養肝方組膠原指數(5.12±0.47)%，模型組膠原沉積指數明顯高于正常組(P<0.05),芪參養肝方組膠原沉積指數明顯低于模型組(P<0.05)。

圖1　正常組小鼠肝組織HE染色表現(×100)

圖2　模型組小鼠肝組織HE染色表現(×100)

圖3　芪參養肝方組小鼠肝組織HE染色表現(×100)

圖4　正常組小鼠肝組織天狼猩紅染色表現(×100)

2.43組小鼠肝組織中α-SMA、TGF-β1、ColⅠ、ColⅢmRNA表達量比較模型組小鼠肝組織中α-SMA 、TGF-β1、ColⅠ、ColⅢmRNA表達量均明顯高于正常組(P均<0.05)，而芪參養肝方組各指標表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見表2。

圖5　模型組小鼠肝組織天狼猩紅染色表現(×100)

圖6　芪參養肝方組小鼠肝組織天狼猩紅染色表現(×100)

組別nα-SMATGF-β1ColⅠColⅢ正常組61.0±0.31.0±0.31.0±0.21.0±0.2模型組615.3±8.7①4.1±1.8①4.6±0.6①22.8±6.1①芪參養肝方組63.7±0.9②2.3±0.3②1.8±0.1②4.6±0.3②

注：①與正常組比較，P<0.05；②與模型組比較，P<0.05。

2.53組小鼠肝組織中α-SMA 、TGF-β1、ColⅠ蛋白表達情況比較模型組小鼠肝組織中α-SMA 、TGF-β1、ColⅠ蛋白表達量明顯高于正常組(P均<0.05)，芪參養肝方組各指標表達量均明顯低于模型組(P均<0.05)。見圖7～9。

圖7　3組小鼠肝組織中α-SMA蛋白表達情況

圖8　3組小鼠肝組織中TGF-β1蛋白表達情況

圖9　3組小鼠肝組織中ColⅠ蛋白表達情況

3討論

肝纖維化是肝臟對慢性損傷刺激的自我修復反應，是慢性肝病向肝硬化發展的必經階段，也是影響慢性肝病預后的重要環節。大量研究已證實肝纖維化在一定條件下可被逆轉[1-2]，所以發病機制的研究就成了肝病攻關的熱點課題之一。研究發現HSC的過度活化是肝纖維化發生的中心環節[3]。HSC在肝內多分布在炎性間隔內，HSC活化增加ECM的形成最終導致纖維化，HSC的收縮作用可能是引起肝纖維化后門靜脈壓力增高的重要因素，而且HSC幾乎能表達基質降解所需要的所有關鍵成分，在ECM降解過程中起著重要的作用[4]。慢性肝病時多種細胞因子、過氧化產物和ECM成分等與HSCs受體結合，經HSCs膜上的特異性受體通過細胞內的信號轉導通路激活核內某些轉錄因子，促進相關靶基因的轉錄和表達，從而促進HSC活化、增殖、轉型[5]。因此，HSC是在肝纖維化進展過程中起重要作用的細胞，抑制HSC的活化、促進活化的HSC凋亡是逆轉肝纖維化的關鍵。

TGF-β是目前公認的最強力的肝纖維化促進因子，是激活HSC并促進其表達ECM的關鍵因子。HSC和受損的肝細胞能自分泌和旁分泌TGF-β，使其呈正反饋性增加，從而加重肝纖維化的進程[6]。有研究表明活化的TGF-β不僅加速靜態HSC向肌成纖維細胞(MFB)轉化，表達α-SMA，而且誘導血小板衍生因子(PDGF)的產生及其受體在HSC上的表達，間接刺激HSC的增殖和活化[7]。

目前國內外尚沒有理想的抗肝纖維化藥物，而中醫通過正確的辨證論治，利用中藥復方多成分、多靶點的作用，在抗肝纖維化的治療中優勢突出。近年來隨著中醫中藥抗肝纖維化研究的逐漸深入，發現具有活血化瘀、補氣健脾功效的中藥有良好的抗肝纖維化作用。本研究所用芪參養肝方中黃芪補氣升陽，鱉甲滋陰潛陽、軟堅散結，二藥共用為君；丹參祛瘀生新而不傷正，“能破宿血，補新血”，為臣；靈芝補肝氣、益脾氣；赤芍清熱涼血、散瘀止痛；五味子益氣補虛強陰；白術健脾益氣，燥濕利水；陳皮理氣健脾，燥濕化痰；柴胡疏肝解郁，引藥入肝經；諸藥合用共奏益氣養陰、活血化瘀、軟堅散結之功?，F代藥理學研究發現，黃芪可以改善肝纖維化患者的肝功能，降低血清ALT、AST水平，減少血清HA、PcⅢ、LN，TGF-β1含量[8-10]；黃芪的有效成分黃芪多糖和黃芪總甙還可以抑制HSC的增殖和膠原合成[11]。鱉甲能明顯抑制TGF-β1刺激的LX-1細胞的增殖，抑制α-SMA、 ColⅠ、ColⅢ、CoLⅣ、LN等因子的表達,促進ECM的降解，抑制HSC活化增殖及ECM合成分泌,促進ECM降解吸收,調控細胞因子水平及信號傳導通路,從而發揮抗肝纖維化的作用[12]。丹參中含有丹參酚、丹參素、丹參酮等多種活性成分，可下調HSC中Smad2、Smad3 mRNA表達并上調Smad7 mRNA表達，通過TGF-β1/Smads信號通路干擾TGF-β1的生物效應，對HSC有直接的抑制作用，起到抑制肝纖維化的作用[13]。靈芝能促進肝臟再生, 加強肝臟的解毒作用及免疫調節作用[14]。赤芍能抑制HSC激活、增殖，促進HSC凋亡，抑制ECM過度沉積[15]，大劑量赤芍能促進肝纖維化重吸收[16]，與黃芪合用有明顯的保肝降酶的作用，能減少HA、LN的沉積，預防治療肝纖維化[17]。

本研究結果表明，模型組血清ALT、AST水平及肝組織中Hyp含量均明顯高于正常組，而芪參養肝方組各指標水平均明顯低于模型組。芪參養肝方組肝小葉破壞及膠原纖維增生較模型組明顯減輕，膠原沉積明顯好轉。模型組肝組織中α-SMA、TGF-β1、Col I、ColⅢ mRNA表達量及α-SMA 、TGF-β1、ColⅠ蛋白表達量均明顯高于正常組，而芪參養肝方組各指標水平均明顯低于模型組。提示芪參養肝方可減少膠原在肝臟的沉積；抑制ConA肝纖維化小鼠α-SMA、TGF-β1分泌，抑制HSC活化，促進活化的HSC凋亡；并能下調ColⅠ、Col Ⅲ mRNA表達，抑制膠原纖維增生；其有保肝降酶、抗肝纖維化作用。

[參考文獻]

[1]O’Connell MA,Rushworth SA. Curcumin:potential for hepatic fibrosis therapy?[J]. Br J Pharmacol,2008,153(3):403-405

[2]Arthur MJ. Fibrogenesis II. Metalloproteinases and their inhibitors in liver fibrosis[J]. Am J Physiol Gastrointest Liver Physiol,2000,279(2):245-249

[3]Friedman SL. Hepatic stellate cells:protean,multifunctional,and enigmatic cells of the liver[J]. Physiol Rev,2008,88(1):125-172

[4]Frideman SL. Liver fibrosis from bench to bedside[J]. Hepatol,2003,38 (1):S38-53

[5]Han YP,Zhou L,Wang J,et al. Essential role of matrix metallop roteinases in interleukine-1-induced myofibroblastic activation of hepatic stellate cell in collagen[J]. J Biol Chem,2004,279(6):4820-4828

[6]Kitamura Y,Ninomiya H. Smad expression of hepatic stellate cells in liver cirrhosis in vivo and hepatic stellate cell line in vitro[J]. Pathol Int,2003,53(1):18-26

[7]李春輝,潘理會. 肝纖維化發生機制的研究進展[J]. 承德醫學院學報,2005,22(1):62-64

[8]陸江，李辰蕊. 黃芪注射液對早期肝硬化患者生化及肝纖維化指標的影響[J]. 山東中醫雜志，2003，22(12):714-715

[9]程鵬，劉素俠，孫晉浩，等. 黃芪抗肝纖維化的作用與TGFβ1的關系[J]. 臨床軍醫雜志，2000,28(3):22-23

[10] 馬紅，王寶恩，馬雪梅. 黃芪抑制大鼠肝星狀細胞增殖及膠原分泌的研究[J]. 中國中醫藥信息雜志，2001，8(4):35-36

[11] 張霄翔，揚雁，陳敏珠. 黃芪多糖對HSC-T6細胞增殖及膠原產生的影響[J]. 中國臨床藥理學與治療學，2003,19(8):892-895

[12] 高建蓉，姚航平，劉焱文，等. 鱉甲水煎液藥物血清對肝星狀細胞的作用[J]. 中華中醫藥學刊，2013,31(11)：2524-2528

[13] 鄭磊，戴立里. 丹參素對轉化生長因子β1刺激肝星狀細胞信號傳導的影響[J]. 重慶醫科大學學報,2009,34 (2):181-185

[14] 吳保杰. 中草藥藥理學[M]. 北京：人民衛生出版社,1983:1108

[15] 張巍. 赤芍對肝纖維化因子ECM等的影響[J]. 臨床合理用藥，2011,4(5A)：74-75

[16] 吳靜. 赤芍的藥理研究及抗肝纖維化臨床應用近況[J]. 中西醫結合肝病雜志，2008,18(3)：189-191

[17] 呂躍山,邢杰,陳英利,等. 黃芪赤芍抗肝纖維化的實驗研究[J]. 中國現代醫學雜志，2008,18(14):1997-2018

Experimental study on anti-hepatic fibrosis effects of Qishen Yanggan Formula

XU Liying1, GAO Yueqiu2, ZHOU Zhenhua2

(1.The Infectious Disease Hospital of Shanghai Huangpu District, Shanghai 200011; 2.Shuguang Hospital, Shanghai 201203, China)

Abstract:Objective It is to observe the influence of Qishen Yanggan Formula (QSYGF) on hepatic stellate cells (HSC) activation, collagen synthesis, cytokine α-SMA and TGF-β1 secretion in liver of mice with liver fibrosis of ConA-induced, and explore its mechanism of anti-fibrotic portions. Methods 40 cases of BALB/c mice were randomly divided into normal group, model group and treatment group. The animals were intragastriced with liquid medicine of QSYGF during the model making. The content of hydroxyproline in liver tissue and liver function in mice were detected in three groups, the mRNA expressions of α-SMA, ColⅠ, ColⅢ and TGF-β1 were measured by RT-PCR and the protein expressions of α-SMA, ColⅠ and TGF-β1 were detected by Western Blot. Results The ALT, AST levels and the content of hydroxyproline in liver tissue in the model group were significantly higher than those in the normal group (all P<0.05), but the indexes in the treatment group were markedly reduced than the model group (all P<0.05). HE and Sirius red staining showed: compared with the model group, the damage of hepatic lobule and collagen fiber hyperplasia was significantly reduced; the collagen deposition was improved obviously in QSYGF group. The mRNA expression level of α-SMA, TGF-β1, ColⅠ, ColⅢ and protein expressions of α-SMA, TGF-β1, ColⅠ in model group were significantly higher than those in the normal group (all P<0.05), while all the indexes in the treatment group were decreased significantly than those in the model group (all P<0.05). Conclusion QSYGF can inhibit the secretion of the cytokine α-SMA, TGF-β1 and HSC activation in ConA-induced liver fibrosis mice model, promote the apoptosis of active HSC, and reduce the mRNA expression of ColⅠand ColⅢ, inhibit collagen hyperplasia; and has good effect of hepatoprotective and anti hepatic fibrosis.

Key words:Qishen Yanggan Formula; ConA; hepatic fibrosis

[收稿日期]2015-08-01

[中圖分類號]R-332

[文獻標識碼]A

[文章編號]1008-8849(2016)06-0593-05

doi:10.3969/j.issn.1008-8849.2016.06.007

[作者簡介]徐莉英，女，主治醫師，研究方向為慢性乙肝肝纖維化的診斷和治療。[通信作者]高月求，E-mail：gaoyueqiu@hotmail.com