韭菜水提液對甘藍枯萎病菌抑制作用初探

曾 鳳 黃永紅 凌 鍵 茆振川 謝丙炎 楊宇紅

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京100081）

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韭菜水提液對甘藍枯萎病菌抑制作用初探

曾 鳳 黃永紅 凌 鍵 茆振川 謝丙炎 楊宇紅*

（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京100081）

摘 要：采用離體抑菌測定和盆栽測定相結合的方法，研究了韭菜水提液對甘藍枯萎病菌1號生理小種的抑制作用和盆栽防治效果。結果表明：韭菜水提液對甘藍枯萎病菌的菌絲生長速率以及孢子萌發率具有明顯的抑制作用，當韭菜水提液濃度為0.75 g·mL-1時，菌絲生長抑制率達到100%；當韭菜水提液濃度為0.25 g·mL-1，處理20 h后觀察，孢子萌發抑制率達95.47%；在盆栽試驗中，基質中加入韭菜水提液濃度為0.086 g·g-1接種15 d后，甘藍枯萎病的防治效率可達40%，甘藍死亡率下降27%。

關鍵詞：韭菜；水提液；甘藍枯萎病菌；盆栽試驗；抑制率

曾鳳，女，碩士研究生，專業方向：分子植物病理學，E-mail：474249677@qq.com

結球甘藍起源于地中海至北海沿岸，是世界上許多國家的主要蔬菜之一。目前，我國甘藍年種植面積約為90萬hm2（楊麗梅 等，2011），在蔬菜的周年供應和出口創匯方面起著重要作用。甘藍枯萎病作為甘藍上的重要病害之一，1895年在美國首次發現（Smith，1899），如今在我國北京、河北等地發生并傳播迅速（李明遠 等，2003），嚴重時甚至會導致毀收絕產，使甘藍種植產業蒙受巨大損失。當前甘藍枯萎病的防治方法主要包括農業防治、生物防治、化學防治等。農業防治主要包括種子處理、輪作、清理病殘體以及選用抗病品種等，但是前幾種方法收效甚微，雖抗病品種防效很好，但目前國內的抗病資源缺乏。而化學防治缺乏有效的藥劑。生物防治及其相關產品的開發成為目前研究熱點。其中，植物源殺菌劑是利用具有殺菌、抑菌活性的某些植物部位或提取其有效成分，或分離純化其單體物質加工成用于防治病害的藥劑（李曉東 等，1995）。已有報道證實許多植物提取液以及分泌物能有效抵御病原菌的侵染，如韭菜提取液對香蕉枯萎病菌的菌絲以及孢子的抑制率可達98%，蔥汁液以及葡萄葉提取物也可抑制黃萎菌，另外有研究分析了植物源農藥解決病原菌抗藥性問題的可能性（何衍彪 等，2005；田菲菲 等，2006；周璇 等，2007；馮巖 等，2010；黃永紅 等，2011；葉倩 等，2013）。

在前人研究的基礎上，本試驗探究了韭菜提取液對甘藍枯萎病菌菌絲生長速率、孢子萌發率的影響以及盆栽防治效果，旨在為甘藍枯萎病的綠色防治提供新的思路。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試菌株：尖孢鐮刀菌甘藍專化型（Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans）1號生理小種52557-TM（Foc）的標準菌株，由美國菌種保存中心（ATCC）提供，中國農業科學院蔬菜花卉研究所真菌病毒組保存。供試品種：韭菜品種為四季香韭，由北京鑫農豐農業技術研究所選育而成；甘藍品種為中甘21號，由中國農業科學院蔬菜花卉研究所選育而成。

1.2試驗設計

試驗于2015年5月1日至7月30日在中國農業科學院蔬菜花卉研究所真菌病毒組實驗室進行。

1.2.1韭菜水提液對甘藍枯萎病菌的離體抑制測定

1.2.1.1韭菜水提液制備 取洗凈晾干的韭菜100 g ，切成5 cm的小段，加20 mL蒸餾水，用榨汁機打碎，裝入離心管，5 000 r·min-1離心10 min，取上清液，共離心4次，直至上清液呈透明色，再用0.22 μm細菌過濾器過濾上清液，得到濃度為5.0 g·mL-1的水提原液，4 ℃保存備用。

1.2.1.2對菌絲生長速率的抑制測定 取Φ9 cm的培養皿，分別加入0、1、2、3 mL的上述韭菜水提原液，用無菌蒸餾水將體積補充至3 mL。將冷卻至37 ℃左右的PDA培養基倒入上述不同處理的培養皿中，每皿20 mL，混勻，此時韭菜水提液濃度分別為0（CK）、0.25、0.50、0.75 g·mL-14個濃度梯度。取一新鮮Foc平板，用Φ0.8 cm打孔器打成大小一致的菌餅，取1個菌餅倒置接到各處理的培養基平板中央，每個濃度梯度重復3皿，28 ℃培養箱培養8 d，每天采用“十”字交叉法測量菌落大小，計算菌絲生長抑制率。

抑制率=（對照菌落直徑-處理菌落直徑）/對照菌落直徑×100%

1.2.1.3對孢子萌發的抑制測定 在500 mL的三角瓶中加入PDB培養基200 mL，接入Foc菌絲進行培養，28 ℃、150 r·min-1搖培4 d后，用4層擦鏡紙過濾（Li et al．，2015），5 000 r·min-1離心10 min后收集孢子。將收集的孢子用新的PDB培養基進行稀釋，調整孢子濃度為1×107個·mL-1，取200 μL分別添加到12個裝有500 μL PDB培養基的2.0 mL離心管中。再分別加入0、50、100、200 μL上述韭菜水提原液，最后用無菌水補充總體積為1 mL，此時韭菜水提液被稀釋成0（CK）、0.25、0.50、1.00 g·mL-1。每處理3次重復，每重復總共200 μL，10、20 h后，用普通光學電鏡觀察孢子萌發情況，每個重復觀察3次，共觀察約100個孢子。

孢子萌發率=萌發孢子總數/孢子總數×100%

孢子萌發抑制率=（對照孢子萌發率-處理孢子萌發率）/對照孢子萌發率×100%

1.2.2韭菜水提液對甘藍枯萎病的盆栽防效測定

1.2.2.1韭菜水提液制備 取洗凈晾干的韭菜200 g，切成5 cm的小段，加100 mL水，用榨汁機打碎，加水至1 000 mL，配制成0.2 g·mL-1的溶液備用。

1.2.2.2土壤處理 分別取0、15、30 mL上述韭菜提取液，與70 g的基質混勻，裝入營養缽中，此時韭菜水提液濃度分別為0（CK）、0.043、0.086 g·g-1。每處理3次重復，每重復種15～20株甘藍苗。

1.2.2.3盆栽接種 將3葉1心期的甘藍幼苗在濃度為1×106個·mL-1的甘藍枯萎病1號生理小種孢子懸浮液中浸泡20 min，移栽到上述營養缽中，放入28 ℃溫室中培養，8 d后開始調查植株發病情況，并根據病情分級標準，統計病情指數。

分級標準：0級，無癥狀；1級，1片葉輕微變黃；2級，1～2片葉葉脈輕至中度變黃：3級，除心葉外，其余葉片中度變黃或萎蔫；4級，全部葉片重度變黃或萎蔫；5級，葉片完全萎蔫并變黃（Li et al．，2015）。

病情指數=Σ（各級發病數×各級代表值）/（處理總數×最高級代表值）×100

2　結果與分析

2.1韭菜水提取液對菌絲生長的抑制作用

圖1　韭菜水提液對甘藍枯萎病菌菌絲生長速率的影響

圖2　接種后6 d韭菜水提液對甘藍枯萎病菌的抑制效果

韭菜水提取液對甘藍枯萎病菌菌絲的生長速率具有明顯的抑制作用，隨著提取液濃度的增大，抑制作用增強；接種6 d后，當濃度達到0.75 g·mL-1時，病原菌完全停止生長，抑制率達到100%（圖1、2）。

2.2韭菜水提液對甘藍枯萎病菌孢子萌發率的影響

由圖2可知，在濃度為0.25 g·mL-1韭菜提取液的PDB培養基中，甘藍枯萎病菌的孢子萌發明顯受到抑制，10 h后處理萌發率僅有0.65%，對照為21.16%；20 h后處理萌發率為2.56%，而對照高達56.57%，抑制率可達95.47%（圖3）。視野中幾乎未看到明顯的孢子萌發痕跡（圖4）。

圖3　韭菜水提液對甘藍枯萎病菌孢子萌發率的影響

圖4　接種后20 h孢子萌發情況（光學電鏡，20×）

圖5　韭菜水提液對甘藍枯萎病的盆栽防效

圖6　接種后第16天甘藍幼苗的生長情況

2.3韭菜水提液對甘藍枯萎病的盆栽防效

由圖5可知，隨著處理土壤中加入韭菜水提液濃度的增加，甘藍枯萎病病情指數顯著降低。當接種14 d時，對照的病情指數為61.38，而韭菜水提液濃度為0.043 g·g-1和0.086 g·g-1處理的病情指數分別為42.73、11.33，防治效果分別達到30.39%、81.54%；韭菜水提液濃度為0.086 g·g-1處理接種15 d時對甘藍枯萎病的防效可達40%，甘藍死亡率下降27%，說明韭菜提取液對減輕甘藍枯萎病發病程度具有很好的作用；接種16 d后，對照幾乎全部死亡，而韭菜水提液濃度為0.043 g·g-1和0.086 g·g-1處理的甘藍苗仍可正常生長，尤其是韭菜水提液濃度為0.086 g·g-1的處理長勢良好（圖6）。但是接種后15 d防效有所降低，表明其持效期可能為14 d左右。

3　結論與討論

甘藍枯萎病是土傳性病害，可以通過多種方式進行傳播，如地下昆蟲、水流以及農事操作等，有時種子也可以帶菌傳播，而近年來發生情況愈加嚴重，危害面積快速上升，可造成甘藍產量損失高達30%以上（張揚 等，2007）。目前很難找到有效、安全的方法防治該病害，所以尋找一種高效、無毒的防治方法具有非常重要的意義。

本試驗通過研究韭菜水提液對甘藍枯萎病病原菌的作用，從菌絲生長、孢子萌發以及病原菌致病力等方面展開試驗，結果表明：韭菜粗水提液對甘藍枯萎病菌具有明顯的抑制作用，這為甘藍枯萎病的防治提供了一種新的參考。但是，本試驗只是初步試驗，不夠深入，如何進一步研究韭菜水提液的殺菌活性以及獲得韭菜中的殺菌物質，并運用到大田中還需要繼續思考。韭菜及其相關產物的開發利用，可能為將來病害的防治提供了高效、安全、環境友好型的新型藥劑。

參考文獻

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何衍彪，詹儒林，趙艷龍，馬蔚紅．2005．20種植物提取物對芒果炭疽菌的抑制作用．熱帶作物學報，26（3）： 86-90．

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Smith E．1899．The fungous infestation of agricultural soils in the United States．Scientific American Supplemen，48：19981-19982.

Primary Studies on Inhibitory Effect of Water Extracts from Allium tuberosum on Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans in Cabbage

ZENG Feng，HUANG Yong-hong，LING Jian，MAO Zhen-chuan，XIE Bing-yan，YANG Yu-hong*
（Institute of Vegetables and Flowers， Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：This paper studied the inhibition role of water extracts from Allium tuberosum on Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans（Foc）and control effect of pot cultivation by combining in vitro antibacterial assay with potted plant measurement. The result indicated that extracts could clearly suppress mycelia growth and spore germination．The inhibition rate was up to 100% when the concentration of waterextracts reached 0.75 g·mL-1. The spore germination inhibition rate reached 95.47% when the added leek extract concentration came to 0.25 g·mL-1and was deal with 20 hours. In pot experiments， the disease control efficiency can reach 40%，and mortality fell by 27% 15 days after the treatment when the concentration of waterextracts reached 0.086 g·g-1in the culture substrate.

Key words：Allium tuberosum；Water extract；Fusarium oxysporum f. sp. conglutinans；Potted plant experiment；Inhibition rate

*通訊作者（

Corresponding author）：楊宇紅，女，研究員，專業方向：植物病理學，E-mail：yangyuhong@caas.cn

收稿日期：2015-08-19；接受日期：2015-11-09

基金項目：國家公益性行業（農業）科研專項（201303014），現代農業產業技術體系建設專項（CARS-25-B-01），中國農業科學院創新工程項目（CAAS-ASTIP-IVFCAAS），農業部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室項目