西瓜3種性型花器官性別分化的細胞形態學觀察

單文英　紀高潔　張潔　宮國義　趙泓　許勇　張海英（北京市農林科學院蔬菜研究中心，農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京100097）

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西瓜3種性型花器官性別分化的細胞形態學觀察

單文英紀高潔張潔宮國義趙泓許勇張海英*
（北京市農林科學院蔬菜研究中心，農業部華北地區園藝作物生物學與種質創制重點實驗室，北京100097）

摘 要：以西瓜3種性型（雌雄異花同株系、全雌系和完全花雄花系）的雄花、雌花和完全花3種花芽為材料，制成石蠟切片，進行西瓜花芽不同發育時期的細胞形態學觀察。結果表明：西瓜3種性型之間性別分化起始及同種性別之間花器官發育過程并沒有明顯的形態學差異。雄花、雌花和完全花3種花芽分化首先要經過一個兩性期，即雄蕊原基和雌蕊原基同時存在時期，在兩性期之前三者不存在明顯的形態學差異；當花芽長度為0.8～1.0 mm時兩性期結束，開始雄花、雌花和完全花的差異發育，此后雄花和完全花的雄蕊原基快速增大，雌花和完全花的雌蕊原基開始分化為柱頭和子房。在3種花芽發育過程中，完全花的花芽在兩性期后明顯比同時期的雄花、雌花的花芽長度更長。全雌系中的“畸形雌花”出現在兩性期后，雌蕊原基的凹陷發育過程受阻，而本該停止發育的雄蕊原基繼續分化，最終發育成可產生少量成熟花粉粒的雄蕊。

關鍵詞：西瓜；性別分化；細胞形態學觀察

單文英，女，碩士，主要從事細胞生物學方面的研究，E-mail：xiguaketi@163.com

西瓜（Citrullus lanatus）屬于葫蘆科西瓜屬。葫蘆科中瓜類作物的花器官有雄花、雌花和完全花3種性別，且具有雌雄異花同株系、全雌系和完全花雄花系等7種不同的性型組合，是研究植物性別分化的典型材料。性別分化不僅影響瓜類作物產量與果實品質（王忠，2000），而且有可能帶來制種技術的變革，如黃瓜制種中利用全雌系能有效地降低人工去雄的成本（王鶴冰 等，2015）。西瓜全雌系突變體的發現（Jiang & Lin，2007），也為西瓜制種技術的變革帶來了曙光。前人已在黃瓜、甜瓜等多種瓜類作物上開展了花芽分化的形態學觀察（Bai et al．，2004；王強 等，2009）、人工性別誘變及其機理研究（丁群英 等，2009），在對控制性別基因的克隆與調控上也取得了顯著進展（婁群峰，2004；曹迪，2009；胡寶剛，2010）。相比黃瓜與甜瓜的研究，西瓜的性型研究并不深入，溫筱玲（1981）和高林旭（2001）僅對西瓜的雄花和雌花進行了簡單的形態學觀察。而目前存在最普遍的西瓜3種性型（雌雄異花同株系、全雌系和完全花雄花系）的研究并不深入。本文從性別分化的細胞形態學入手，以西瓜雌雄異花同株系、全雌系和完全花雄花系的雄花、雌花和完全花花芽為試驗材料，將不同發育時期的3種花芽制成石蠟切片后進行細胞形態學觀察，以明確其在細胞學和形態學上的分化差異以及3種花芽分化的發育分界點，以及全雌系雌花發育過程中的某些特征，為深入開展西瓜性別控制機制的研究與生產利用奠定基礎。

1　材料與方法

1.1試驗材料

試驗于2014年3～12月在北京市農林科學院蔬菜研究中心進行。供試西瓜雌雄異花同株系材料為新紅寶，全雌系材料為新紅寶雌性突變體，完全花雄花系材料為蘇聯3號，均由本單位西瓜課題組提供。

1.2試驗方法

采集盛花期西瓜雌雄異花同株系、全雌系雌性突變體和完全花雄花系材料的莖尖生長點（包括幼小的雄花、雌花和完全花）及成熟雄花、雌花和完全花的花蕾，并立刻用FAA（formaldehyde-acetic acid-ethanol）固定液進行固定保存。從固定液中取出莖尖及花蕾，按照常規程序制作石蠟切片，經酒精系列脫水、二甲苯透明、浸蠟、石蠟包埋、縱切（切片厚度6～8 μm）、展片、脫蠟、番紅-固綠染色、封藏，選擇結構完整、有代表性、染色清晰的石蠟切片，用中性樹膠封藏，制作成永久切片（李和平，2009）。利用Nikon TE2000-U型顯微鏡觀察切片并照相（林加涵 等，2000）。

2　結果與分析

通過對西瓜3種性型花芽分化的細胞形態學觀察發現，3種性型之間性別分化起始及同種性別之間花器官發育過程并沒有明顯差異；但在利用全雌系的雌花進行花芽分化觀察時，發現存在“畸形雌花”的現象。

2.1西瓜花芽分化從起始到兩性期的細胞形態學特征

圖1　西瓜兩性期前的花芽分化過程

西瓜花芽從起始到兩性期分化過程經歷了5個時期，包括花芽原基分化期、花萼原基形成期、花瓣原基形成期、雄蕊原基初生期和兩性期（圖1）。第1時期為花芽原基分化期，此時花芽長度約為0.1 mm，在葉分化終止的葉腋分生組織處產生圓形突起狀的花芽原基，其分生組織細胞形狀相似、體積小、分裂活躍（圖1-a）；第2時期為花萼原基形成期，此時花芽長度約為0.2 mm，表現為圓形突起狀的花芽原基伸長變寬，頂端微凹，由于邊緣細胞分裂不均，其中5處分裂較快，形成5個突起的花萼原基，在縱切面上只能看到2個突起（圖1-b）；當花芽長度約為0.3 mm時進入第3個時期，即花瓣原基形成期，隨著花萼原基的伸長變寬，其內側基部形成與花萼原基相同的圓錐狀突起，即花瓣原基（圖1-c）；隨花萼原基和花瓣原基的不斷伸長，當花芽長度約為0.4 mm時進入第4個時期，花瓣原基內側基部形成新的突起為雄蕊原基，此時期為雄蕊原基初生期（圖1-d）；第5個時期為兩性期，此時花芽長度約為0.5 mm，在雄蕊原基內側基部繼續形成2個突起，即為雌蕊原基（圖1-e）。西瓜花芽分化過程與甜瓜等作物相同（郝敬紅 等，2007），都經歷了兩性期，即雄蕊原基與雌蕊原基同時存在的時期。

2.2西瓜花芽由兩性期發育為雄花的細胞形態學特征

西瓜花芽由兩性期發育為雄花的過程經歷了5個時期，包括雄蕊分化期、花粉母細胞形成期、四分體時期、小孢子時期和成熟花粉粒時期（圖2）。

當花芽的長度約為0.8 mm時，雌蕊原基停止發育，而雄蕊原基不斷伸長膨大，中部稍凹陷，形成如腎形的結構，然后分化出5枚雄蕊，其中4枚雄蕊兩兩結合并與獨立的1枚一起形成3組雄蕊。其后，雄蕊基部開始變細形成花絲，頂部進一步發育產生花藥原始體。表明花藥和花絲分化的開始，即雄蕊分化期（圖2-a）。隨著花藥原始體的不斷發育，花芽長度約為2 mm時，孢原細胞經過多次有絲分裂后發育成小孢子母細胞，即花粉母細胞形成期（圖2-b、c）。花芽長度為3～4 mm時，花粉母細胞經過減數分裂形成集合在一起的4個單倍體小孢子，即四分體時期（圖2-d）。花芽長度為5～10mm時，小孢子彼此分離，此時的小孢子是未成熟的花粉粒，體積較小無明顯液泡，即小孢子時期（圖2-e）。花芽長度為10～20 mm時，小孢子發育形成成熟的花粉粒，此時圍繞小孢子的一圈排列緊密的一層細胞，即絨粘層已經退化解體，其營養物質被花粉粒吸收利用，為成熟花粉粒時期（圖2-f）。

2.3西瓜花芽由兩性期發育為雌花的細胞形態學特征

西瓜由兩性期花芽發育為雌花的過程共經歷7個時期，包括雌蕊分化期、柱頭初生期、子房形成期、胎座形成期、胚珠原基分化期、大孢子母細胞時期和胚珠形成期（圖3）。

圖2　西瓜雄花發育過程

圖3　西瓜雌花發育過程

當花芽長度為1～2 mm時，雄蕊原基發育受抑制，只是有限大小的增長，而雌蕊原基頂端開始分化，基部開始增粗伸長，中間位置開始向下凹陷，此為雌蕊分化期（圖3-a）；花芽長度為2～3 mm時，開始產生子房室，雄蕊在形態上沒有很大變化，花柱和柱頭進一步分化，此時柱頭剛形成，即柱頭初生期（圖3-b）；花芽長度為3～4 mm時，子房不斷膨大逐漸成型，開始產生3心皮的子房室，此時期即為子房形成期（圖3-c）；花芽長度為5～8 mm時，子房內部多個張開心皮的邊緣彼此聯合分化形成胎座，此為胎座形成期（圖3-d）；花芽長度為8～10 mm時，胎座處分化出的細胞聚集成團狀，形成胚珠原基，此為胚珠原基分化期（圖3-e、f）；花芽長度為10～15 mm時，胚珠原基不斷分化產生大孢子母細胞，即大孢子母細胞時期（圖3-g）；花芽長度為15～20 mm時，大孢子母細胞經過不斷分裂最終形成胚珠，即胚珠形成期（圖3-h）。

一般正常的雌花中只有雌蕊，雄花中只有雄蕊，完全花中同時擁有雌蕊和雄蕊2種性器官；但在利用全雌系的雌花進行花芽分化觀察時，發現存在“畸形雌花”的現象。從形態學觀察，“畸形雌花”的子房只有微小膨大（圖4-a），遠遠小于正常雌花的子房，但卻可以清晰地看到雄蕊（圖4-b）。細胞學觀察“畸形雌花”分化過程顯示：在兩性期時，“畸形雌花”與正常雌花的形態和發育過程是一致的；兩性期之后，“畸形雌花”雌蕊原基基部開始也表現為增粗伸長并向下凹陷（圖4-c），但向下凹陷發育到一定程度之后停止發育（圖4-d），而其雄蕊原基并沒有像正常雌花一樣停止膨大伸長，反而繼續分化發育（圖4-e），最終形成正常的生殖器官，從圖4-f可看到成熟的花粉粒。

圖4　西瓜“畸形雌花”及其發育過程

2.4西瓜花芽由兩性期發育為完全花的細胞形態學特征

西瓜花芽由兩性期發育為完全花的過程，分為花粉母細胞形成期和子房形成期、四分體時期和胎座形成期、小孢子時期和胚珠原基分化期、成熟花粉粒時期和大孢子母細胞時期、胚珠形成期（圖5）。觀察結果顯示：雖然雄蕊原基和雌蕊原基同時分化發育，但雄、雌性器官的發育進度不同。

當花芽長度為6～8 mm時，雄蕊分化形成花粉母細胞，而狹長的子房剛剛開始膨大進入子房形成期（圖5-a）；花芽長度為8～10 mm時，花粉母細胞進入四分體時期，子房內部心皮的邊緣彼此聯合進入胎座形成期（圖5-b）；花芽長度為10～15 mm時，雄蕊分化形成小孢子，子房進入胚珠原基分化期（圖5-c）；花芽長度為15～20 mm時，花粉成熟（圖5-d），大孢子母細胞開始形成（圖5-e）；花芽長度為20～30 mm時，大孢子母細胞最終分化發育形成胚珠，即胚珠形成期（圖5-f）。

從完全花的發育過程可以看出，西瓜花芽從兩性期到產生大孢子和小孢子所用的時間不同，形成小孢子的時間較短，這與陳學好等（2002）對黃瓜雄、雌花芽分化的觀察結果一致。同時，對相同發育時期的雄花、雌花和完全花長度進行比較，雄花的花芽長度最短，完全花長度最長。

圖5　西瓜完全花發育過程

3　結論與討論

前人已在黃瓜、甜瓜等多種瓜類作物上開展花芽分化的形態學觀察（Bai et al．，2004；王強 等，2009），并將瓜類作物的花芽分化發育過程分為花芽原基形成階段、花萼與花瓣分化階段、雄蕊形成階段、性型分化階段和花成熟階段（鄧儉英 等，2006）。本試驗根據細胞形態學觀察及各個時期發育特征的描述對西瓜雄花、雌花和完全花分化發育步驟進行明確的劃分，西瓜花芽從起始發育到兩性期經歷了5個時期：花芽原基分化期、花萼原基形成期、花瓣原基形成期、雄蕊原基初生期、兩性期。在王強等（2009）對甜瓜性別分化的研究中，花瓣原基形成后只分化出1個圓錐形突起，即雌、雄花兩性原基，兩性原基繼續發育為雄蕊原基和雌蕊原基；但本試驗的觀察結果顯示，花瓣原基形成之后就依次分化出雄蕊原基和雌蕊原基。雄花、雌花、完全花均經歷相同的兩性期發育過程，當花芽長度為0.8～1.0 mm時兩性期結束，開始雄花、雌花和完全花的差異發育。西瓜花芽由兩性期發育為雄花經歷了5個時期：雄蕊分化期、花粉母細胞形成期、四分體時期、小孢子時期、成熟花粉粒時期；西瓜花芽由兩性期發育為雌花經歷了7個時期：雌蕊分化期、柱頭初生期、子房形成期、胎座形成期、胚珠原基分化期、大孢子母細胞時期、胚珠形成期；西瓜花芽由兩性期發育為完全花經歷了5個時期：花粉母細胞形成期和子房形成期、四分體時期和胎座形成期、小孢子時期和胚珠原基分化期、成熟花粉粒時期和大孢子母細胞時期、胚珠形成期。

此外，本試驗還發現：在兩性期后，全雌系中易出現“畸形雌花”，“畸形雌花”的雌蕊原基基部向下凹陷發育到一定程度后停止發育，而其雄蕊原基并沒有像正常雌花一樣停止伸長膨大，反而繼續分化發育形成正常的生殖器官并產生少量的成熟花粉粒。“畸形雌花”的形成可能受許多因素影響，如激素調節、環境變化、營養缺乏、特定基因表達等（曲波 等，2010），“畸形雌花”的形成機制尚不清楚，有待于進一步研究。

瓜類作物是植物性別決定機制研究的重要作物，其性別分化非常復雜，尤其在性別決定基因的時空表達分析時很難抓住其關鍵作用時期。在Antoine等（2009）對甜瓜的研究中，通過原位雜交技術在細胞學層面上對甜瓜性別決定基因進行原位表達驗證，證實了甜瓜性別決定機制是受1對隱性主效基因控制，為西瓜性別決定基因的研究提供了重要參考，也證實了西瓜性別發育細胞學形態研究是必要而亟需的。本試驗對西瓜花芽分化發育進行了詳細的細胞形態學觀察，基本確定了性別決定的關鍵期為兩性期，為今后開展西瓜性別決定基因及機制的研究提供了技術線索。

參考文獻

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Cytomorphological Observation on Three Kinds of Sexual Type Sex Differentiation in Watermelon

SHAN Wen-ying，JI Gao-jie，ZHANG Jie，GONG Guo-yi，ZHAO Hong，XU Yong，ZHANG Hai-ying*
〔Beijing Vegetable Research Centre，Beijing Academy of Agricalture and Ferestry Science，Key Laboratory of Biology and Genetic Improvement of Horticultural Crops （North China），Ministry of Agriculture，Beijing 100097，China〕

Abstract：Taking male，female and hermaphrodite flower of 3 kinds of watermelon （Citrullus lanatus）sexual type as material，we made these flower buds at different development stages into paraffin section for cytomorphological observation．The result showed that the floral primordial processes of these 3 kinds of sexual type from watermelon had no visible differences. At the end of hermaphroditic stage，the length of flower bud was about 0.8-1.0 mm and the differentiation development of male，female and hermaphrodite flower began. Stamen primordia volume of male and hermaphrodite flower augmented rapidly，and carpel primordia of female and hermaphrodite flower began to differentiate into stigma and ovary．In deformity female flower，the base of carpel primordia would stop the development after denting to a certain degree，while the stamen primordia would not stop elongation and continue to develop to form the mature stamen with small amount of mature pollen grains.

Key words：Watermelon；Sex differentiation；Cytomorphological observation

*通訊作者（

Corresponding author）：張海英，女，博士，研究員，主要從事瓜類蔬菜遺傳育種和分子生物學方面的研究，E-mail：zhanghaiying@nercv.org

收稿日期：2015-05-08；接受日期：2015-07-04

基金項目：國家自然科學基金項目（31171980），科技部科技支撐計劃項目（2013BAD01B04，2014BAD01B09），農業部產業體系項目（CARS-26），北京市科委項目（Z121105002612013，Z141100002314019）