番茄粉紅色果實相關基因的dCAPS和InDel標記開發與應用

董淑芳　王孝宣　高建昌　國艷梅　黃澤軍　杜永臣（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

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番茄粉紅色果實相關基因的dCAPS和InDel標記開發與應用

董淑芳王孝宣高建昌國艷梅黃澤軍杜永臣*
（中國農業科學院蔬菜花卉研究所，北京 100081）

摘 要：采用Super BSA方法分別構建100份粉紅色番茄材料和100份紅色番茄材料的DNA混合池，對測序結果的SNP位點進行分析。結果表明：在1號染色體上的127個SNP位點中，有6個與番茄果實顏色高度相關，其中1個位點與粉紅色果實高度相關。利用該SNP位點開發了1個共顯性dCAPS標記，在紅色、粉紅色和雜合F13種基因型之間的多態性較好。同時，利用番茄重測序數據分析番茄起源時發現，在粉紅色番茄中SIMYB12基因的上游存在1個603 bp的缺失，利用該缺失突變位點開發了1個共顯性InDel標記，在紅色、粉紅色和雜合F13種基因型之間也表現出較好的多態性。利用新開發的2個標記對F2群體進行遺傳分析，鑒定結果與田間表型觀察結果符合度均達到95%以上，表明這2個標記可以用于番茄苗期分子標記輔助選擇。

關鍵詞：番茄；粉紅色果實；dCAPS；InDel；分子標記

董淑芳，女，碩士研究生，專業方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：shufangdong04@163.com

番茄（Lycopersicon esculentum Mill.）是世界人民喜愛的重要蔬菜作物。據聯合國糧食及農業組織（FAO）統計，2013年全球番茄年產量為163 963 萬t。番茄在我國栽培歷史雖短，但已經成為主要的蔬菜作物之一，年種植面積已達125.5萬hm2（1 882.5萬畝），年產量3 010.2萬t（董春娟 等，2015）。番茄品種多、用途廣、營養豐富，番茄紅素有很強的抗氧化功能，具有較高的營養價值和保健作用。隨著人民生活水平的提高，消費者對番茄大小、形狀、顏色、風味、耐貯運性等不斷提出更高的要求，生產上迫切需要品質好、抗性強、產量高的番茄品種（裴華麗 等，2014）。

粉紅色番茄受到中國、日本、韓國等亞洲人的喜愛。在中國北方地區粉紅色番茄的需求量很大，近年來南方地區對粉紅色番茄的需求量也在逐漸提升。因此，高品質粉紅色番茄品種的選育已是我國重要的育種目標之一。但由于中國非番茄原產地，番茄種質均直接或間接引自國外，而且多數為紅色果實，不太符合中國、日本、韓國等亞洲人的消費習慣，所以在育種中常需要將紅色番茄材料轉育為粉紅色。番茄粉紅色果實由隱性基因y控制，采用常規的育種方法需要在F2才能通過表型進行選擇。因此，開發與番茄粉紅色果實性狀緊密連鎖的分子標記，可極大地提高苗期選擇的效率。

Adato等（2009）克隆了與番茄透明果皮相關的基因SIMYB12，但是根據其公布的分子標記對育種材料進行鑒定的結果與國內多數粉紅色番茄材料不符合。因此，中國農業科學院蔬菜花卉研究所鮮食番茄課題組于2013年將100份高代粉紅色番茄材料和100份紅色番茄材料進行了混合建池，擬采用Super BSA（bulked segregation analysis）方法開發與番茄粉紅色果實緊密連鎖的分子標記。

最近，本所鮮食番茄課題組在利用番茄重測序數據分析番茄起源時發現，在粉紅色番茄中SIMYB12基因的上游71 247～71 250 Mb之間存在1個603 bp的缺失，而紅色番茄則不存在缺失現象；另外在部分粉紅色番茄中存在兩個無義突變，一個突變是替換（在71 255～71 256 Mb之間，由T堿基替換C堿基）；另一個突變是插入（在71 255～71 256 Mb之間，在TG之間插入1個堿基A），這兩個突變導致了終止密碼子提前出現，可能是引起透明果皮的原因（Lin et al.，2014）。

基于上述研究結果，本試驗擬同時利用Super BSA方法和InDel標記方法篩選出與番茄粉紅色果實相關的簡單適用的分子標記，以提高粉紅色番茄材料的選擇效率。

1　材料與方法

1.1試驗材料

供試高代純合粉紅色番茄自交系材料100份、紅色番茄自交系材料100份、紅色番茄親本材料15g-80、粉紅色番茄親本材料15g-91及其F2，均由本所鮮食番茄課題組提供。

所有試材于2013年播種于本所順義基地溫室中，每份材料種植13株、F2種植200株，均按常規方法種植與管理。

1.2試驗方法

1.2.1DNA提取 番茄幼苗二葉一心時，取2片長約1 cm的新鮮幼嫩葉片，采用改良CTAB法（Fulton et al.，1995）提取DNA。

1.2.2混合池構建 對提取的DNA用1%瓊脂糖凝膠進行質量檢測，上樣量為5 μL，DNA 1 μL，上樣緩沖液3 μL，ddH2O 1 μL。達到測序的要求后，將100份粉紅色番茄材料的DNA各1 μg混合均勻組成P1混合池，基因型定義為aa；將100份紅色番茄材料的DNA各1 μg混合均勻組成R2混合池，基因型定義為ab。用MseⅠ 酶（購自Promega公司）對混合池的DNA進行酶切，酶切體系為：基因組DNA 500 ng，NEB buffer4 1 μL，MseⅠ 酶0.12 μL，加ddH2O補至50 μL。酶切方法為：37 ℃水浴15 h，然后利用QIAGEN試劑盒（購自QIAGEN公司）純化，用50 μL EB回溶。酶切之后用1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，收集長度在380～410 bp之間的DNA片段，組成2個SLAF-seq文庫。

1.2.3測序 將酶切產生的不同類型的末端進行平端化修復，同時對5′末端進行磷酸化修飾。在5′磷酸化的平端DNA片段3′末端添加1個“A”，以便后續與5′端有1個突出“T”的solexa接頭進行互補連接，從而提高接頭連接效率，同時阻止solexa接頭自連。使不同的DNA片段具有相同的末端序列，從而可以雜交到芯片（flow cell）上，進行擴增、測序。根據前期酶切預測軟件的分析結果選擇切膠范圍，以獲得相應的標簽數。增大起始模板量，達到上機測序所需量。將前步處理好的樣品進行精確定量（Qubit），然后在flow cell表面進行橋式PCR，使DNA片段擴增為單分子DNA簇（此過程在Cluster Station中進行）。單分子DNA簇長好后將flow cell移入Hi-Seq中，進行測序。

1.2.4信息分析 對測序得到的各樣品的讀長（reads）數據進行評估，通過相似性聚類、基因型糾錯后，再定位到基因組上，得到SLAF標簽，對SLAF標簽進行多態性分析，得到樣品間的多態性標記，然后進行關聯分析，定位性狀相關候選區域。

1.2.5SLAF標簽獲得 基因組經酶切后變為多個小片段，每個片段相當于1個標記位點，同一位點reads序列通過相似性聚類，形成1個集合；集合中高深度片段即為潛在基因型，低深度片段可能是測序錯誤，通過糾錯策略對低深度片段進行糾正，最終獲得具有1個或多個等位基因的SLAF標簽。

1.2.6SNP位點分析 根據經典番茄遺傳圖譜和Adato等（2009）、Ballester等（2010）的研究結果，已知透明果皮基因位于1號染色體上，因此本試驗重點對1號染色體上的127個SNP位點進行分析，將每個SNP位點定義為野生型（W）與突變型（M），對野生型與突變型基因型進行分析。如果粉紅色番茄材料與紅色番茄材料在2種基因型中出現的比例接近1∶1，則該SNP位點在粉紅色番茄材料和紅色番茄材料之間不具有較好的多態性，不能用于分子標記的開發；如果突變型或野生型基因型只出現在紅色番茄材料或粉紅色番茄材料中，或者兩者的比例很高或很低，則該SNP位點在粉紅色番茄材料和紅色番茄材料之間有較好的多態性，可以用于分子標記的開發。

1.2.7dCAPS標記開發 對篩選得到的在粉紅色番茄材料和紅色番茄材料之間表現出多態性的SNP位點，利用DNAMAN軟件對目的SNP位點進行EcoRⅠ 內切酶位點分析，利用Primer Premier進行CAPS分子標記設計，在CAPS標記的基礎上通過在擴增引物中引入錯配堿基，從而引入1個EcoRⅠ 的酶切位點，理論上由紅色番茄基因擴增出來的譜帶沒有酶切位點，由粉紅色番茄基因擴增出來的譜帶有1個酶切位點，該標記的上游引物為P-F：5′-GATGAGATTGAGATTGCTAC-3′；下游引物為P-R：5′-TCTCTCCAGTGCTCTGATGGTTTC TGAATT-3′。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.8InDel分子標記開發 本所鮮食番茄課題組在利用番茄重測序數據分析番茄起源時發現，在粉紅色番茄中SIMYB12基因的上游71 247～71 250 Mb之間存在1個603 bp的缺失，而紅色番茄則不存在缺失現象。利用缺失位點（圖1）設計了4個InDel標記，引物序列見表1。

圖1　透明果皮基因SIMYB12的結構以及603 bp的缺失位點

表1　4個InDel標記的引物序列

1.2.9PCR擴增 dCAPS標記的PCR反應體系采用的模板是番茄基因組DNA，利用特異性引物進行擴增。PCR反應體系（15 μL）為：Mix 7.5 μL，正反向引物各0.5 μL，模板DNA 1 μL，加ddH2O補齊到15 μL。PCR擴增程序為：94 ℃預變性3 min；94 ℃變性30 s，56 ℃退火45 s（不同引物的退火溫度根據引物合成說明書適當調整，一般為55～60 ℃），72 ℃延伸50 s，35個循環；72℃延伸10 min；最后16 ℃保存。取8 μL PCR擴增產物，用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，用Bio-Rad公司的凝膠成像系統照相。利用EcoRⅠ對PCR產物進行酶切，酶切體系為：PCR產物15 μL，10×buffer EcoRⅠ 2 μL，EcoRⅠ 酶0.2 μL，加ddH2O補至20 μL。用1.8%瓊脂糖凝膠電泳檢測，EB染色，采用凝膠成像系統照相。

InDel標記的PCR擴增程序與dCAPS標記相同，采用3%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

2　結果與分析

2.1SLAF標簽分析

對各樣品的測序數據進行評估，包括讀取長度、數量和GC含量，aa、ab的讀取長度均為90 bp，其中aa共讀取16 069 195次，ab共讀取14 311 858次；粉紅色番茄混合池和紅色番茄混合池中GC含量分別為41.38%和41.48%（表2）。獲得的標簽數量為50 062個，整體平均深度達200.94×。根據等位基因數和基因序列之間的差異，對50 062個SLAF標簽進行多態性分析，共得到4種類型的SLAF標簽，其中SNP共有3 793個，占全部SLAF標簽的7.58%；無多態性的SLAF標簽45 766個，占全部SLAF標簽的91.42%；未知的有91個，占全部SLAF標簽的0.18%；重復的有412個，占全部SLAF標簽的0.82%（表3）。其中多態性標記為SNP，稱為Marker。

表2　紅色番茄、粉紅色番茄測序數據統計結果

表3　紅色番茄、粉紅色番茄DNA混合池SLAF統計結果

2.2與番茄粉紅色果實相關的SNP位點篩選

根據經典番茄遺傳圖譜和Adato等（2009）的研究結果已知透明果皮基因位于1號染色體上，因此本試驗重點對1號染色體上的127個SNP位點進行分析，發現其中6個SNP位點與目的基因高度相關（表4）：在SNP位點1中，在紅色番茄材料中共測出野生型基因型38次，在粉紅色番茄材料中沒有檢測到；在粉紅色番茄材料和紅色番茄材料中分別測出突變型基因型76次和54次。在SNP位點2中，在紅色番茄材料中共測出野生型基因型42次，在粉紅色番茄材料中沒有檢測到；在粉紅色番茄材料和紅色番茄材料中分別測出突變型基因型98次和61次。在SNP位點3中，在紅色番茄材料中共測出野生型基因型50次，在粉紅色番茄材料中沒有檢測到；在粉紅色番茄材料和紅色番茄材料中分別測出突變型基因型108次和52次。在SNP位點4中，在粉紅色番茄材料和紅色番茄材料中分別測出野生型基因型41次和44次；在紅色番茄材料中共測出突變型基因型23次，在粉紅色番茄材料中沒有檢測到。在SNP位點5中，在粉紅色番茄材料和紅色番茄材料中分別測出野生型基因型33次和80次；在粉紅色番茄材料中共測出突變型基因型40次，在紅色番茄材料中沒有檢測到。在SNP位點6中，在粉紅色番茄材料中共檢測出野生型基因型179次，在紅色番茄材料中沒有檢測到；在粉紅色番茄材料和紅色番茄材料中分別測出突變型基因型84次和220次。

經過分析，第6個SNP位點的野生型基因型僅存在于粉紅色番茄材料中，突變型基因型主要存在于紅色番茄材料中。因此，重點對該SNP位點進行dCAPS分子標記開發。

表4　番茄1號染色體上與果實顏色相關的SNP位點

2.3dCAPS標記的獲得

利用DNAMAN軟件對第6個SNP位點所在246 bp片段進行EcoRⅠ 的酶切位點分析，通過引物設計引入錯配堿基和1個EcoRⅠ 的酶切位點。

由圖2可知，利用該標記對粉紅色番茄、紅色番茄及其F1進行PCR擴增，均獲得了長度為270 bp的產物。利用EcoRⅠ 對PCR產物進行酶切，粉紅色番茄得到1條180 bp大小的譜帶；紅色番茄得到1條220 bp的譜帶。

圖2　dCAPS標記的PCR產物及EcoRⅠ 酶切產物電泳圖譜

利用該標記對F2的200株單株進行遺傳分析，其鑒定結果與田間表型觀察結果符合性較好，符合度達到95%以上。

2.4InDel分子標記的獲得

根據透明果皮基因SIMYB12啟動子上游的缺失設計了4個InDel分子標記，將其引物（表1）之中的2～3個進行相互組合，對純合粉紅色番茄、純合紅色番茄及雜合F1進行分析。結果表明引物組合fc-F2、fc-R2，FCPF1、FCPR1，FCPM1、FCPM2難以區分父本、母本及雜合基因型；其中，以引物FCPF1、FCPR1構成的InDel標記具有多態性，但不能區分紅色番茄親本及雜合基因型，而且譜帶不清晰（圖3）。

圖3　與粉紅色番茄相關基因SIMYB12的Indel標記檢測結果

引物組合分析表明（圖3），引物組合fc-F2、 FCPM2及fc-R2構成的InDel標記在粉紅色番茄中特異擴增出1條450 bp大小的譜帶，在紅色番茄中特異擴增出1條155 bp大小的譜帶，在雜合F1中擴增出2條分子量分別為155 bp和450 bp的譜帶；利用該標記對F2的200株單株進行遺傳分析，其鑒定結果與田間表型觀察結果符合性較好，符合度也達到95%以上。

綜合分析dCAPS標記與InDel標記在父本、母本、F1及F2群體之間的多態性，發現這2個標記的遺傳鑒定結果與田間觀測結果的一致性和符合性均較好，因此本試驗開發的dCAPS標記與InDel標記均可以用于粉紅色番茄的苗期輔助篩選。

3　結論與討論

本試驗采用Super BSA測序技術獲得了1個與粉紅色番茄高度相關的SNP位點，并根據該位點開發出1個較為準確的dCAPS標記；同時又根據番茄重測序數據發現的缺失位點篩選獲得1個InDel標記。這2個標記的遺傳鑒定結果與田間觀察結果的符合性較好，符合度均超過95%，均可以用于粉紅色番茄的選育。特別是在回交育種中，在需要將高代紅色番茄親本材料轉育為粉紅色親本材料而其他農藝性狀完全一致時，通過1次雜交、連續5～6次回交和分子標記輔助選擇，每世代通過分子標記篩選后只需要種植3～5株，最后再進行1次自交，就可以在2～3 a內完成育種材料的選育，從而節省大量的人力、物力和財力。這2個標記的應用將極大地加速粉紅色番茄的育種進程。

參考文獻

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· 信息 ·

Development and Application of dCAPS and InDel Markers in Pink Tomato Fruitrelated Genes

DONG Shu-fang，WANG Xiao-xuan，GAO Jian-chang，GUO Yan-mei，HUANG Ze-jun，DU Yong-chen*
（Institute of Vegetables and Flowers，Chinese Academy of Agricultural Sciences，Beijing 100081，China）

Abstract：Super BSA was performed to screen SNP between 2 mixed DNA pools，which contained 100 pink tomatoes and 100 red tomatoes．SNPs of the tested result were analyzed．The result indicated that 6 SNPs among 127 SNPs on chromosome 1 were highly correlated with the color of tomato fruit，and 1 SNP was closely linked to pink tomato fruit．By this SNP，a polymorphism dCAPS was developed and showed well correlation with red，pink and heterozygous genotypes．It is recently reported that a 603 bp deletion was characterized at the upstream of SIMYB12 gene in pink tomato．Using this deletion，a InDel marker was developed and also showed good polymorphism among red，pink and heterozygous genotypes．These 2 newly developed molecular markers were further used to analyze genetically the F2population．The result was in line with the field observation．Their accordance rate was above 95%，which suggested that these 2 markers can be used for molecular marker assisted selection in tomato breeding．

Key words：Tomato；Pink fruit；dCAPS；InDel；Molecular marker

*通訊作者（

Corresponding author）：杜永臣，研究員，博士生導師，專業方向：蔬菜遺傳育種，E-mail：duyongchen@caas.cn

收稿日期：2015-04-09；接受日期：2015-06-02

基金項目：國家自然科學基金項目（31372070，31171963），農業部園藝作物生物學與種質創制重點實驗室項目