495例血小板相關免疫球蛋白檢測結果的臨床資料分析

甘慧泉,歐陽維富,劉惠蘭,林　婷,羅燕飛,冼璐樺,周茂華

(廣東省人民醫(yī)院、廣東省醫(yī)學科學院 病理醫(yī)學部 檢驗科，廣東 廣州510000)

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495例血小板相關免疫球蛋白檢測結果的臨床資料分析

甘慧泉,歐陽維富,劉惠蘭,林婷,羅燕飛,冼璐樺,周茂華*

(廣東省人民醫(yī)院、廣東省醫(yī)學科學院 病理醫(yī)學部 檢驗科，廣東 廣州510000)

血小板自身抗體可導致血小板破壞增加或生成障礙，導致患者發(fā)生出血性疾病。血小板自身抗體可分為特異性糖蛋白自身抗體、藥物相關自身抗體、抗同種血小板抗體和血小板相關免疫球蛋白(platelet associated immunoglobulin，PAIg)等。PAIg包括PAIgG、PAIgM、PAIgA[1]。流式細胞術(Flow Cytometry，F(xiàn)CM)檢測PAIg具有快速、靈敏、 重復性好的特點。本文就495例用FCM檢測的PAIg結果的相關資料進行分析。

1對象與方法

1.1對象2012年1月至2013年9月來廣東省人民醫(yī)院就診，行PAIg檢測的門診及住院病人495例，其中男245例，女250例。年齡0-85歲，平均年齡37±29歲。

1.2儀器與試劑

1.2.1主要儀器FACScalibur 流式細胞儀(購自美國BD公司)。

1.2.2主要試劑PE-CD41(購自美國BECKMAN COULTER公司)；Goat F(ab，)2 IgG-FITC、 Goat F(ab，)2 Anti-human IgG-FITC、 Goat F(ab，)2 Anti-human IgM-FITC鼠IgG、Goat F(ab，)2 Anti-human IgA-FITC(均為美國Southern Biotech 公司產(chǎn)品)。

1.3方法

1.3.1樣本制備留取清晨空腹靜脈血3 mL于乙二胺四乙酸( EDTA-K2 )抗凝管中,用150 g 離心力離心5 min,分離富含血小板血漿(PRP),取PRP 50-200 μL(根據(jù)血小板多少取適量，調(diào)整細胞濃度為106/mL)，置于管A中，加入2 mL 含小牛血清磷酸鹽緩沖液(PBS-BSA)2 100 g離心5 min，洗3次。去上清液后，加 400 μL PBS-BSA重懸。在管 A 中加入20 μL CD41-PE，充分混勻。另取4支試管，分別加入Goat F(ab，)2 IgG-FITC、Goat F(ab，)2 Anti-human IgG-FITC、Goat F(ab，)2 Anti-human IgM-FITC鼠IgG、Goat F(ab，)2 Anti-human IgA-FITC 4 種單抗試劑 10 μL，再在各試管中分別加入管A中的血小板懸液 100 μL，室溫避光孵育15 min。再加入 PBS-BSA 2 mL，2100g 離心5 min洗滌1次，去上清后加0.5 mL固定液(4%甲醛溶液)。

1.3.2流式分析根據(jù) CD41/SSC 設置血小板門，以同型對照管調(diào)整電壓及熒光補償，檢測標本 PAIgG、PAIgM、PAIgA 陽性百分率。PAIgG>2.0%，PAIgA>2.0%，PAIgM>3.5%，該項結果即判為陽性。

1.4統(tǒng)計與分析采用SPSS 16.0 軟件進行數(shù)據(jù)處理，計數(shù)資料用率表示，率的比較采用χ2檢驗，以P<0.05 表示有統(tǒng)計學差異。

2結果

PAIg檢測，PAIgG、PAIgM、PAIgA三項中只要有一項結果陽性，則計PAIg結果為陽性。

2.1性別495例PAIg檢測，男女檢測結果見表1。Pearson Chi-Square檢驗，χ2=0.41，P=0.52。PAIg陽性率在性別上沒有差異。

2.2年齡年齡分組檢測結果見表2。Pearson Chi-Square檢驗，χ2=6.99，P=0.07。PAIg陽性率在不同年齡分組之間沒有差異。

表1495例患者PAIg檢測結果

性別PAIg陽性PAIg陰性例數(shù)男101144245女96154250共計197298495

表2495例不同年齡組患者PAIg檢測結果

年齡(歲)PAIg陽性PAIg陰性例數(shù)0-16(少年組)688014817-30(青年組)28639131-59(中年組)536912260歲-85(老年組)4886134共計197298495

2.3不同抗體197例PAIg陽性標本中，有178例次PAIgM陽性(90.36%)、89例次PAIgG陽性(45.18%)，19例次PAIgA陽性(9.64%)。PAIgM的檢出率明顯高于另外兩種抗體。

2.4其他相關資料495例患者檢測PAIg的同時，還有部分病例進行了血清降鈣素原(PCT)、直接/間接抗人球蛋白(coombs-D/coombs-I)和幽門螺旋桿菌(HP)的檢測，結果整理如下。2.4.1PCT183例患者同時檢測PAIg和PCT，結果見表3。PCT>0.05 ng/ml為陽性界值。Pearson Chi-Square檢驗，χ2=11.38，P=0.00。PAIg陽性率在不同的PCT結果之間具有統(tǒng)計學差異。

表3183例同時檢測PAIg和PCT患者的結果

PCT>0.05ng/mlPCT≤0.05ng/mlPAIg陽性5925PAIg陰性4554共計10479

2.4.2Coombs-D 198例患者同時檢測PAIg和coombs-D，結果見表4。Pearson Chi-Square檢驗，χ2=8.41，P=0.00。PAIg陽性率在不同的coombs-D結果之間具有統(tǒng)計學差異。

表4198例同時檢測PAIg和coombs-D患者的結果

coombs-D陽性coombs-D陰性PAIg陽性4145PAIg陰性3181共計72126

2.4.3Coombs-I 196例患者同時檢測PAIg和coombs-I，結果見表5。Pearson Chi-Square檢驗，χ2=0.11，P=0.74。PAIg陽性率在不同的coombs-I結果之間沒有統(tǒng)計學差異。

表5196例同時檢測PAIg和coombs-I患者的結果

coombs-I陽性coombs-I陰性PAIg陽性482PAIg陰性3107共計7189

2.4.4HP47例患者同時檢測PAIg和HP，結果見表6。Pearson Chi-Square檢驗，χ2=1.40，P=0.24。PAIg陽性率在不同的 HP結果之間沒有統(tǒng)計學差異。

表647例同時檢測PAIg和HP患者的結果

HP+HP-PAIg陽性1011PAIg陰性818共計1829

3討論

PAIg可能來源于機體免疫系統(tǒng)針對血小板骨架蛋白或膜糖蛋白產(chǎn)生的自身抗體而結合在血小板膜上，也可能是血清中抗體分子或抗原抗體復合物在血小板表面的粘附或覆蓋。此外，血小板激活時，α顆粒可釋放IgG分子至血小板表面。因此PAIg測定的特異性并不高，但具有較高的靈敏度[2]。

本文就FCM檢測PAIg的結果，結合相關的其他臨床資料分析顯示，年齡、性別與PAIg陽性結果沒有相關性。

PCT是近年研究較多的用于監(jiān)測感染的指標，尤其對診斷細菌性感染有著較高的特異性及敏感性。正常人PCT在血清中含量<0.05 ng/ml(熒光定量法)，而當機體受到細菌感染后PCT含量明顯升高，在感染得到控制后，PCT可迅速降至正常。而在病毒感染，自身免疫性疾病及腫瘤等疾病時PCT水平可輕微升高或維持正常[3，4]。本文資料統(tǒng)計結果顯示，PCT陽性與否和PAIg陽性結果之間具有統(tǒng)計學差異。即細菌感染患者更易PAIg陽性。推測其機制可能是：某些菌體成分與血小板抗原成分交叉，導致機體產(chǎn)生抗血小板抗體；細菌產(chǎn)生的毒素直接或間接激活了免疫系統(tǒng)，打破了機體的免疫平衡狀態(tài)。細菌感染誘導血小板表面某些抗原改變，被機體免疫系統(tǒng)識別，產(chǎn)生相關抗體等。這也提示，在診斷患者血小板減少的病因時，應該排除細菌感染的影響。

Coombs-I是檢查血清中游離的不完全抗體。本室采用的FCM法檢測PAIg時，中間有3次洗滌PRP的步驟，即使標本coombs-I陽性，血漿中游離的不完全抗體也被洗掉了。所以理論上Coombs-I結果不會影響PAIg，本文資料統(tǒng)計的結果也印證了這一點。Coombs-D是檢查被檢紅細胞上有無不完全抗體。其結果陽性是由于患者自身紅細胞被致敏或有異常蛋白附著所致。本文統(tǒng)計資料結果顯示，coombs-D陽性結果與PAIg結果之間有相關性，說明致敏紅細胞的不完全抗體或異常蛋白也可能會粘附或覆蓋在血小板表面。紅細胞致敏的患者主要見于：自身免疫性貧血；輸血史；藥物誘發(fā)的免疫性溶血性貧血；自身免疫性疾病等。提示臨床，治療coombs-D陽性患者血小板減少時，治本還是關鍵。

特發(fā)性血小板減少性紫癜(ITP)主要是由于抗血小板自身抗體引起的血小板減少，并導致出血傾向的一種自身免疫性疾病。Gasbarrini等[5]于1998年提出，幽門螺桿菌(HP)感染與ITP的發(fā)病有關。國內(nèi)饒燕飛等[6]，李霞等[7]的報道也驗證了這一點。目前，國內(nèi)外多數(shù)研究表明，根除HP后部分ITP患者的血小板計數(shù)明顯增多，并伴隨血清血小板相關抗體水平的下降，提示HP可能是部分ITP的致病因子之一。但也有報道認為HP感染與ITP發(fā)病的關系仍有爭論[8，9]。本文結果顯示，HP感染與否與PAIg之間沒有關聯(lián)。考慮原因有兩點：①統(tǒng)計例數(shù)少，本文僅47例患者做HP檢測；②感染HP的毒力亞株不同。臨床HP菌株分為高毒力株(表達CagA蛋白)和低毒力株(不表達CagA蛋白)。Takahashi等[10]認為，HP的CagA蛋白具有和人類血小板抗原相同或相似的抗原表位，感染HP后機體免疫應答通過分子模擬產(chǎn)生抗血小板自身抗體從而引發(fā)ITP。提示由于HP菌株的毒力亞株不同結果相異的可能性。

參考文獻：

[1]劉艷榮.實用流式細胞術[M].1版，北京：北京大學醫(yī)學出版社，2013:321.

[2]劉艷榮.實用流式細胞術[M].1版，北京：北京大學醫(yī)學出版社，2013:323.

[3]楊玉敏，王文統(tǒng)，章華萍，等.綜合干預措施對重癥監(jiān)護病房中心靜脈導管相關感染的影響[J].中華臨床感染病雜志，2012，5(3)：177.

[4]陳鴻恩，黃麗輝.血清降鈣素原測定在感染性疾病中的診斷價值[J].檢驗醫(yī)學與臨床，2008,5(1)：20.

[5]Gasbarrini A，F(xiàn)ranceschi F，Tartaglione R，et al.Regreession of autoimmune thrombocytopenia after eradication of helicobacter pylori[J].Lancet，1998,352(9):878.

[6]饒燕飛，嚴志民，楊桂珍，等．幽門螺桿菌感染在特發(fā)性血小板減少性紫癜中的臨床意義[J].重慶醫(yī)學，2012，41(2)：113.

[7]李霞，任增蘇．ITP患者血清幽門螺桿菌及人細小病毒B19抗體檢測的臨床分析[J].山東醫(yī)學高等專科學校學報，2011,33(5):343.

[8]Jarque I，Andreu R.Absence of Platelet response after eradication Helicobacter pylori in patients with chronic idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Br J Haematol，2001，115(4):1002.

[9]Michel M，Khellaf M，Desforges L，et al.Autoimmune thrombocytopenic purpura and Helicobacter pylori infection[J].Arch Intern Med，2002，162(9):1033.

[10]Takahashi T，Yujiri T，Shinohara K，et al.Molecular mimicry by Helicobacter pylori CagA protein may be involved in the pathogenesis of H.pylori associated chronic idiopathic thrombocytopenic purpura[J].Br J Haematol，2004，124(1)：91.

(收稿日期：2014-12-10)

作者簡介：甘慧泉(1978-)，女，湖北黃石人，主管技師，碩士，主要從事流式細胞術在臨床血液病方面的診斷工作。

*通訊作者

文章編號：1007-4287(2016)04-0662-03