miR-122在腎癌中的異常表達及其臨床意義

曹　拓，趙春娟，余振東

(1.北京大學深圳醫院 a.檢驗科；b.生物治療室，廣東 深圳518036；2.汕頭大學醫學院；3.深圳市沙井人民醫院)

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miR-122在腎癌中的異常表達及其臨床意義

曹拓1a，2，趙春娟3，余振東1b*

(1.北京大學深圳醫院 a.檢驗科；b.生物治療室，廣東 深圳518036；2.汕頭大學醫學院；3.深圳市沙井人民醫院)

摘要：目的探討腎癌中miR-122的表達特點及臨床意義。方法基于前期平行測序的工作基礎，對51例腎癌及相應癌旁組織、15例腎癌患者血清及15例健康對照者血清中miR-122的表達水平進行RT-qPCR檢測，分析miR-122的表達高低與腎癌患者臨床病理特征之間的相關性；并通過在腎癌細胞系(786-O和ACHN)中轉染miR-122 inhibitors，觀察轉染后細胞的增殖改變，初步探討miR-122的生物學功能。結果相對于癌旁組織，腎癌組織中miR-122表達水平明顯升高，上調率為82.35%；相比于健康對照者血清，腎癌患者血清中的miR-122表達亦明顯升高，上調率為100%。腎癌組織中miR-122的表達水平與腎癌患者的臨床病理特征無顯著相關性(P>0.05)。在腎癌細胞系(786-O和ACHN)中轉染miR-122 inhibitors后，腫瘤細胞的增殖受到抑制。結論miR-122可能參與到腎癌的病理過程，研究腎癌中miR-122的表達特點及生物學功能可能對早期診斷及治療腎癌具有潛在的臨床價值。

關鍵詞：微小RNA；miR-122；腎細胞癌

(ChinJLabDiagn,2016,20:0559)

腎細胞癌(簡稱腎癌)是人群中最常見的十大惡性腫瘤之一[1]。在全球范圍內，每年有超過270000例的新發腎癌病例被診斷出來，并導致每年發生110000死亡病例數[2]。盡管腎癌的致死率逐漸趨于平緩，但是腎癌的發生率仍在逐漸上升[2]。因此，本研究擬通過實時熒光定量PCR技術檢測腎癌組織及腎癌病人血清中miR-122的表達情況，探討其表達高低與患者臨床病理特征之間的關聯性；并通過在腎癌細胞系中轉染miR-122 inhibitor的方法，來初步探究miR-122在腎癌中的生物學功能，為后續深入的功能及機制研究探索奠定基礎。

1材料與方法

1.1材料

1.1.1組織和血清樣本51例腎癌及配對的癌旁組織樣本收集于北京大學深圳醫院、安徽醫科大學附屬醫院及中山大學附屬腫瘤醫院，組織標本剪碎后浸泡于RNAlater(Qiagen)中保存，再轉移至-80℃冰箱凍存備用。15例腎癌患者血清樣本及作對照用的15例健康者血清樣本均從北京大學深圳醫院檢驗科收集，血清樣本分裝于1.5 ml離心管后于-80℃凍存備用。所有腎癌組織樣本取自于術前未經過任何形式的抗腫瘤治療的患者，并且所獲取組織樣本全部經過經驗豐富的病理醫師確診。腎癌標本的臨床病理分期采用WHO腎癌分型標準和美國癌癥聯合會分期系統作為參考依據。實驗樣本(組織和血清)的獲取及使用均獲得患者知情同意，并通過了醫院倫理委員會批準。

1.1.2主要試劑材料用于組織和血清中miRNAs提取、逆轉錄及熒光定量的試劑(miRNeasy Mini Kit、miRNeasy Serum/Plasma Kit、miScript Reverse Transcription Kit和miScript SYBR Green PCR Kit)均為Qiagen公司(德國)產品。miR-122熒光定量反應中上游特異性引物為5’-TGGAGTGTGACAATGGTGTTTG-3’，由Invitrogen 公司(美國)合成，其下游引物為試劑盒中提供的通用引物(詳見miScript Reverse Transcription Kit說明書)。以U6為內參基因，作熒光定量檢測的參比，特異性引物的上游及下游序列分別為5’-CTCGCTTCGGCAGCACA-3’和5’-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3’，均由Invitrogen 公司(美國)合成。MTT試劑購自Sigma公司(美國)。轉染試劑Lipofectamine 2000購自Invitrogen公司(美國)。DMEM培養基及胎牛血清(FBS)均為Gibco公司(美國)的產品。

1.1.3實驗細胞系ACHN和786-O細胞購自ATCC(美國)。

1.2方法

1.2.1組織及血清miRNAs提取分別采用miRNeasy Mini Kit、miRNeasy Serum/Plasma Kit提取組織和血清中的miRNAs。按試劑盒說明書進行。

1.2.2miRNAs逆轉錄合成cDNA及實時熒光定量PCR檢測參考miScript Reverse Transcription Kit 試劑盒說明書進行操作。參照miScript SYBR Green PCR Kit說明書進行熒光定量反應的體系設置。血清以及組織樣本的熒光定量檢測分為實驗組與對照組。腎癌患者血清樣本、腎癌組織樣本中miRNAs表達量定義為實驗組(c)，健康志愿者血清樣本及癌旁相應正常組織中miRNAs表達量定義為對照組(n)。miR-122作為檢測目的基因，以U6的表達水平作為內參對熒光定量進行標準化處理。當定量PCR反應的熒光強度達到設定閾值時，所經過的循環反應數以CT值表示。ΔCTc=CTc目的-CTc內參，ΔCTn=CTn目的-CTn內參；公式中CTc目的代表腎癌或腎癌患者血清樣本中miR-122的CT值，CTn目的代表癌旁正常組織或健康對照者血清樣本中miR-122的CT值，CTc內參代表腎癌組織或腎癌患者血清樣本中內參基因U6的CT值，CTn內參代表癌旁正常組織或健康對照者血清樣本中內參基因U6的CT值。miR-122相對于對照組的表達水平(Re)采用ΔΔCT的方法進行分析處理:Re=2-ΔΔCT，ΔΔCT=ΔCTc-ΔCTn。依據miR-122的表達(log2Re)狀況，將51例腎癌組織樣本分為高表達組與低表達組；以log2Re等于2為界限， 大于或等于2的樣本劃為高表達組，小于2的樣本劃為低表達組。

1.2.3組織和血清樣本RT-qPCR產物凝膠電泳將熒光定量PCR反應擴增產物與Loading buffer(6x)以5：1的比例均勻混合，在1%瓊脂糖凝膠的中進行電泳，根據電泳條帶的亮度來驗證RT-qPCR數據的可靠性。

1.2.4腎癌細胞轉染及轉染后細胞增殖的檢測轉染分三組進行：(1)inhibitor組，即加入合成的miR-122 inhibitors和轉染試劑脂質體；(2)inhibitor control組，即加入對照序列和脂質體；(3)mock組，僅加入脂質體。首先，將約6×103個細胞(ACHN和786-O細胞)接種于96孔板，24 h后將經opti-MEM稀釋后的miR-122 inhibitors和對照序列(濃度均為50 nm/L)加入到細胞培養液中，空白組僅加入脂質體。在轉染0 h，24 h，48 h，72 h后每孔加入20 μl MTT(5 mg/ml)，繼續于37℃溫箱中孵育培養4 h。最后，小心移除培養孔中的液體，在每孔中加入150 μl DMSO，震蕩混勻，直到無可見沉淀存在，以490 nm為檢測波長、以630 nm為參考波長，在酶標儀上測定每孔的吸光值(OD值)。

1.2.5統計分析所有實驗數據采用SPSS20.0統計軟件進行分析。腎癌及相應癌旁組織、腎癌患者血清及配對健康對照者血清中的miR-122的表達水平的差異采用配對樣本t檢驗方法進行分析；細胞轉染實驗中三個分組之間在同一時間點細胞數量(OD值)的差異采用方差分析來進行評估；腎癌組織中miR-122的相對表達水平與腎癌患者臨床病理特征間的關系采用四格表卡方檢驗和R×C表Fisher的精確檢驗統計處理；差異有統計學意義的判定標準為P值小于0.05。

2結果

2.1miR-122在腎癌組織和腎癌患者血清中表達水平顯著升高

如圖1所示，miR-122在腎癌組織中呈現顯著高表達(t=7.925，P<0.001)，相對于癌旁的正常組織，在51例癌組織樣本中，42例發生miR-122表達上調，上調率為82.35%。如圖2所示，miR-122在腎癌患者血清中亦呈現顯著高表達(t=4.32，P<0.001)，在15例配對血清樣本中，miR-122在全部腎癌患者血清中呈高表達，上調率為100%。

圖1　　　　miR-122在51例腎癌組織中的相對表達量

圖2　　　　miR-122在15例腎癌患者血清中的相對表達量

2.2組織和血清RT-qPCR產物凝膠電泳驗證

組織和血清中miR-122熒光定量PCR產物凝膠電泳結果如圖3所示，組織實驗組(T)和血清實驗組(S)條帶C(cancerous)均要亮于條帶N(normal)，說明與配對的對照樣本相比，miR-122在腎癌組織和腎癌患者血清中的表達均上調，與RT-qPCR實驗數據分析結果相對應。

2.3轉染miR-122 inhibitors可抑制腎癌細胞系的增殖

腎癌細胞系(ACHN和786-O)在轉染miR-122 inhibitors后采用MTT法檢測細胞系的增殖變化。如圖4中A、B所示，miR-122 inhibitor組細胞生長曲線與inhibitor control組、mock組細胞生長曲線有明顯差異；inhibitor control組與mock組之間無顯著差異。采用ANOVA統計分析顯示miR-122 inhibitors轉染組的細胞增殖速度較其它兩組細胞下降，說明降低miR-122的表達可能對腎癌細胞系ACHN、786-O的增殖有抑制作用。

M:marker；C:腎癌組織或腎癌患者血清；N:癌旁組織或健康對照者血清; T:組織樣本；S:血清樣本

miR-122 inhibitors轉染組與inhibitor control組、mock組之間在同一時間點的差異分別用*和#來表示，*或者#代表P<0.05，**或者##代表P<0.01

圖4miR-122 inhibitors抑制腎癌細胞系786-O和ACHN的增殖

2.4腎癌組織中miR-122表達水平與腎癌患者臨床病理特征之間的相關性

51例腎癌組織樣本分為miR-122高表達組(36例)和低表達組(15例),分組的標準依據方法1.2.2所述進行。以55歲為界限，將患者分為兩組。按性別統計患者中男性與女性的例數。采用卡方檢驗和R×C表Fisher的精確檢驗統計方法評估miR-122的表達水平與患者臨床病理特征之間的相關性。如表1所示，采用四格表卡方檢驗分析發現，患者年齡、性別因素與miR-122的表達水平無相關性(P值均>0.05)；采用R×C表Fisher確切概率計算發現，miR-122的表達水平與患者腫瘤的病理類型和TNM分期亦無顯著相關性(P值均>0.05)。

表151例腎癌患者癌組織中miR-122的表達水平與臨床病理特征的關系

臨床病理特征病例數miR-122的表達水平高表達低表達檢驗統計量P值年齡/歲 ≦55241410 >55272253.2790.070性別 男28208 女231670.0210.884病理類型 透明細胞癌34268 乳頭狀癌1376 其他#4312.4070.248TNM分期 T1-2N0M0443113 T3-4N0M0431 不明*3210.3971.000

#病理類型不明確；*TNM分期不明確。

3討論

MicroRNAs在正常細胞與和癌細胞中的表達有差異，它們能在一定程度上反映出組織特異性的表達特征，并且在不同的細胞及組織環境中促進或者抑制腫瘤的發生與發展，充當癌基因或抑癌基因[3,4]。研究特定類型的腫瘤中miRNAs的表達特征和功能作用為腫瘤的早期診斷、治療和預后評估提供了方向和策略。MiR-122作為肝臟特異性的微小RNA，其在肝炎相關的損傷、非酒精性脂肪性肝病、藥物誘導性肝臟疾病和肝臟腫瘤等疾病中的表達特征、生物學功能及分子機制都被深入研究[5-8]。miR-122的表達在肝臟腫瘤中發生顯著下調，對于肝臟腫瘤的形成其主要發揮抑癌的作用[9]。而在我們前期腎癌組織測序的結果當中，miR-122是表達最顯著上調的微小RNA之一，其在10例測序的腎癌組織中平均上調近25倍[10]。本研究通過對51例配對的腎癌及癌旁組織進行RT-qPCR檢測，證實miR-122在腎癌組織中顯著高表達，驗證了前期我們的測序結果，提示miR-122在腎癌的發生發展中可能扮演促癌的角色。同時，我們對腎癌患者的血清也進行了表達水平的檢測，發現miR-122在患者血清中也呈現高表達，與腎癌組織中miR-122表達水平的檢測結果相印證。外周血中的miRNAs可以免受核糖核酸酶的降解作用而穩定存在是由于受其外周囊泡膜的保護，因此可以作為一種血清標志物而被檢測[11]。MiR-122在15例腎癌患者的血清中都呈現高表達，提示其可能作為一種腎癌相關的血清標志物而具有早期診斷、預后評估的潛在臨床價值。腎癌患者血清中miR-122高上調率(15/15)的出現可能與所檢測的樣本例數較少有關，更大樣本量的血清有待于實驗檢測。

本研究通過在腎癌細胞系中轉染miR-122的抑制物，觀察腫瘤細胞的增殖改變，來初步探究miR-122在腎癌細胞中的生物學功能。在轉染了miR-122的抑制物后，細胞增殖速率降低，結果具有統計學意義，提示miR-122充當癌基因而促進細胞增殖的可能性。靶向干擾miR-122的功能可能會減緩腎癌發展、起到緩解患者病情的作用。

在肝癌細胞系中過表達miR-122，能通過直接靶向降低AKT3的水平來抑制細胞增殖、遷移，并誘導肝癌細胞凋亡，發揮抑瘤作用[9]；在乳腺癌中，miR-122通過特異性地降低IGF1R的表達水平,調節PI3K/Akt/mTOR/p70S6K信號通路來發揮腫瘤抑制作用[12]。與之相矛盾，本研究發現miR-122在腎癌的病理過程中可能發揮促癌作用。由于miRNAs通常以不完全互補的方式與其靶基因結合，從而發揮其調節功能，因此同一個miRNA可能會有多個靶基因，能通過不同的信號通路在不同的腫瘤類型中發揮不一致甚至截然相反的作用。本實驗組探討了miR-122在腎癌中的表達和生物學功能，但對于miR-122的作用機制需要進一步深入研究。

綜上所述，本實驗利用了實時熒光定量PCR技術證明了miR-122在腎癌組織中及腎癌患者血清中的高表達特點，且應用細胞轉染技術初步探討了miR-122在腎癌中起促癌作用的可能性，并分析闡明miR-122的相對表達水平與所選樣本的臨床病理特征無顯著相關性。以上研究初步討論了miR-122在腎癌病理過程中可能的重要作用和意義，為后續深入研究其在腎癌中的作用機制奠定基礎，也為將miR-122作為腎臟腫瘤基因治療的新靶點提供了參考和實驗依據。

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The abnormal expression of miR-122 in human renal cell carcinoma and its clinical significance

CAOTuo,ZHAOChun-juan,YUZhen-dong.

(DepartmentofClinicalLaboratory,PekingUniversityShenzhenHospital,Shenzhen518036,China)

Abstract:ObjectiveTo explore the expression levels of miR-122 in the tumor tissues and sera of patients with renal cell carcinoma and analyze its clinical significance.MethodsTotal RNAs from 51 pairs of human renal cell carcinoma and matched adjacent normal tissues were isolated and used for synthesis of the first-strand cDNA.Meanwhile,15 pairs of serum samples from cancer patients and matched healthy control subjects were subjected to RNA isolation and reverse transcription.The expression levels of miR-122 were analyzed by quantitative real-time PCR.Then,the relationship between the expression level of miR-122 in tumor tissue and clinicopathological characteristic was investigated.Furthermore,ACHN and 786-O cell lines were transfected with miR-122 inhibitors for characterization of the biological function of miR-122.ResultsCompared with the corresponding adjacent tissues and matched serum controls,the expression levels of miR-122 in tumor tissues and patients’ sera were significantly increased,with calculated ratio of upregulation at 82.35 percent and 100 percent,separately.However,there’s no correlation between the expression level of miR-122 and the age,gender,pathological classification and TNM stage of patients with renal cell carcinoma.MTT assay showed that tumor cells transfected with synthesized miR-122 inhibitors proliferated at a lower rate than that of control groups.ConclusionmiR-122 may be involved in the development and progression of renal cell carcinoma.This study of miR-122 expression may display potential application significance for the early diagnosis and treatment of renal cell carcinoma.

Key words:microRNAs;miR-122;renal cell carcinoma

(收稿日期：2015-01-29)

中圖分類號：R737.11

文獻標識碼：A

*通訊作者

基金項目：深圳市科技計劃項目(JCYJ20140415162543037)；深圳市衛生計生系統科研項目(201401049)

文章編號：1007-4287(2016)04-0559-05