重組抗菌蛋白R(shí)eg3γ的表達(dá)、純化及鑒定

劉　彤，馮　野，高永建，丁大勇

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胃結(jié)直腸肛門外科,吉林 長(zhǎng)春130033)

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重組抗菌蛋白R(shí)eg3γ的表達(dá)、純化及鑒定

劉彤，馮野，高永建，丁大勇*

(吉林大學(xué)中日聯(lián)誼醫(yī)院 胃結(jié)直腸肛門外科,吉林 長(zhǎng)春130033)

哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)存在大量共生菌，這些共生菌對(duì)宿主的營(yíng)養(yǎng)代謝有重要意義。宿主需要對(duì)腸腔內(nèi)的細(xì)菌進(jìn)行一定的動(dòng)態(tài)防御，腸道內(nèi)抗菌蛋白是腸道防御機(jī)制中重要的一項(xiàng)。再生蛋白3是一組由小腸paneth細(xì)胞分泌到腸腔的抗菌凝集素，大小約為16KD，包括小鼠Reg3γ和人HIP/PAP。目前，對(duì)于該類蛋白的表達(dá)和調(diào)控，各種功能的具體機(jī)制還不清楚。本文利用生物工程技術(shù)表達(dá)、純化重組Reg3γ蛋白質(zhì)，并對(duì)純化的重組蛋白進(jìn)行了鑒定，為進(jìn)一步分析再生蛋白3的功能及作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

1材料與方法

1.1材料

鼠小腸cDNA庫(kù)由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建保存，來(lái)源于C57BL小鼠小腸組織。載體質(zhì)粒pET-30b(+)購(gòu)自Novagen公司；感受態(tài)細(xì)胞DH5α、各種限制性內(nèi)切酶、連接酶及DNA聚合酶購(gòu)自TaKaRa公司；真核表達(dá)大腸桿菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL購(gòu)自Agilent Technologies公司；透析袋(MWCO 6,000-8,000)購(gòu)自Spectrum Laboratories公司；SP Sepharose Fast Flow 陽(yáng)離子交換柱及SephacrylTMS-200 HR凝膠過(guò)濾柱購(gòu)自GE Healthcare；兔抗鼠Reg3γ抗體購(gòu)自Life Science INC；辣根過(guò)氧化物酶偶聯(lián)二抗購(gòu)自Amersham Pharmacia。

1.2實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1表達(dá)載體構(gòu)建根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的鼠Reg3γ基因mRNA序列(基因號(hào)NM_011260.1)，利用Primer Express version.1.5設(shè)計(jì)引物。Reg3γ上游引物：5′-ATTGCGAGGCATATGGAAGTTGCCAA GAAAGATGCCCCAT -3′；Reg3γ下游引物：5′- CTATGGGGATCCCTAGGCCTTGAATTTGCAG ACATAGGGT -3′ 。上游引物包含NdeI酶切位點(diǎn)(用下劃線表示)，下游引物包含BamHI酶切(用下劃線表示)。PCR反應(yīng)條件為：94℃2分后94℃20秒、60℃30秒、72℃30秒行30個(gè)循環(huán)，最后72℃5分。

將pET-30b(+)質(zhì)粒和Reg3γPCR產(chǎn)物進(jìn)行雙酶切。使用DNA連接酶將預(yù)處理的目的片段和載體連接成為重組質(zhì)粒pET-30b(+)-Reg3γ，重組質(zhì)粒擴(kuò)增抽提后，行質(zhì)粒雙酶切鑒定及測(cè)序。熱沖擊法將經(jīng)過(guò)鑒定的重組表達(dá)質(zhì)粒轉(zhuǎn)化工程大腸桿菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL，應(yīng)用含卡那霉素和氯霉素的雙抗LB培養(yǎng)基篩選，完成表達(dá)載體的構(gòu)建。

1.2.2重組蛋白的小量制備及實(shí)驗(yàn)條件確定從轉(zhuǎn)化的表達(dá)細(xì)菌平板上挑菌到1 ml LB液體培養(yǎng)基(含有卡那霉素30 μg/ml和氯霉素50 μg/ml)，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。取培養(yǎng)過(guò)夜的菌液50 μl加入新的3 ml LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)2-4小時(shí)，使細(xì)菌OD達(dá)到0.6。菌液中加入0.5 mM IPTG后繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)2-6小時(shí)。收集菌液4℃6 500 g離心15分鐘，收集沉淀的細(xì)菌。細(xì)菌沉淀以清洗緩沖液重懸，以超聲破碎器將細(xì)菌破碎，4℃10 000 g離心10分鐘，沉淀和上清行SDS-PAGE檢測(cè)，確定重組蛋白的可溶性。調(diào)整培養(yǎng)誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度，確定最佳的表達(dá)條件。

1.2.3重組蛋白質(zhì)的大量表達(dá)根據(jù)小量制備的條件進(jìn)行重組蛋白質(zhì)的大量表達(dá)。從轉(zhuǎn)化的表達(dá)細(xì)菌平板上挑菌到20 ml LB液體培養(yǎng)基，37℃振蕩培養(yǎng)過(guò)夜。將培養(yǎng)過(guò)夜的菌液加入500 ml LB液體培養(yǎng)基內(nèi)，37℃振蕩培養(yǎng)4小時(shí)，使細(xì)菌OD達(dá)到0.6。菌液中加入0.5mM IPTG后繼續(xù)37℃振蕩培養(yǎng)6小時(shí)。菌液加入10枚50 ml離心管，4℃6 500 g離心15分鐘，棄去上清液。各離心管細(xì)菌沉淀以2.5 ml 清洗緩沖液重懸。收集菌液至5枚50 ml離心管中，每枚5毫升。1分鐘，分2次以超聲細(xì)胞破碎器將細(xì)菌破碎。將細(xì)菌破碎液收集到4枚15 ml離心管中，4℃10 000 g離心10分鐘，棄上清，沉淀部分以清洗緩沖液重懸，以勻漿器勻漿2次。4℃10 000 g離心10分鐘，棄上清，沉淀以重懸緩沖液(2.5 ml×4)重懸，室溫下振蕩2小時(shí)。將重懸液緩慢滴入復(fù)性緩沖液中，4℃緩慢攪拌24小時(shí)。

1.2.4重組蛋白的純化以上表達(dá)蛋白及復(fù)性液在室溫下10 000 g離心30分鐘，留取上清液，加入透析袋中。將透析袋放入5L透析緩沖液中， 4℃透析24小時(shí)，過(guò)濾復(fù)性液體中小分子雜質(zhì)。使用SP Sepharose Fast Flow陽(yáng)離子交換柱和SephacrylTMS-200 HR凝膠過(guò)濾柱來(lái)純化重組蛋白。

1.2.5SDS-PAGE及Western Blotting檢測(cè)取重組蛋白樣品20 μl上樣，用5%濃縮膠和15%分離膠行SDS-PAGE電泳，電泳條件為定電流5 mA 20分鐘,20 mA 90分鐘。電泳后的凝膠根據(jù)需要行考馬斯亮藍(lán)染色或Western Blotting檢測(cè)。Western Blotting檢測(cè)中Reg3γ抗體濃度1∶2 000，二抗?jié)舛葹?∶1 000。

2結(jié)果

2.1表達(dá)載體構(gòu)建

通過(guò)PCR進(jìn)行擴(kuò)增的目的基因行瓊脂糖凝膠電泳顯示擴(kuò)增出的條帶大小與理論值(474 bp)推測(cè)基本相符(圖1)。

pET-30b(+)質(zhì)粒及PCR后回收的基因片段經(jīng)NdeI和BamHI雙酶切后連接通過(guò)DNA連接酶連接成為重組質(zhì)粒pET-30b(+)-Reg3γ。為了進(jìn)一步確定重組質(zhì)粒的正確插入，我們進(jìn)行重組質(zhì)粒抽提純，行雙酶切鑒定。酶切后DNA電泳圖譜可見(jiàn)兩段片段，與理論大小一致(圖2)。

2.2重組蛋白的小量制備及實(shí)驗(yàn)條件確定

為確定表達(dá)細(xì)菌E. coli BL21-CodonPlus (DE3)-RIL的轉(zhuǎn)化成功及重組蛋白在大腸桿菌中的表達(dá)位置，我們進(jìn)行重組蛋白R(shí)eg3γ的小量制備。在表達(dá)過(guò)程中，選取未加IPTG誘導(dǎo)菌液、IPTG誘導(dǎo)菌液、菌液離心的上清液、細(xì)菌裂解后的離心和上清液5個(gè)樣本行SDS-PAGE和考馬斯亮藍(lán)染色。如圖3所示經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，有明顯16KD大小的蛋白質(zhì)表達(dá)，與理論Reg3蛋白大小相符。

細(xì)菌經(jīng)超聲裂解后，其上清液無(wú)重組蛋白的表達(dá)，在沉淀中有目標(biāo)蛋白的表達(dá)。該結(jié)果說(shuō)明重組Reg3蛋白質(zhì)是不溶的包涵體狀態(tài)，為取得有功能的重組蛋白需要進(jìn)一步行包涵體的溶解復(fù)性和純化。通過(guò)調(diào)整培養(yǎng)誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度，確定最佳的表達(dá)條件為IPTG誘導(dǎo)濃度使用0.5 mM/L，IPTG的誘導(dǎo)時(shí)間為6小時(shí)(圖4)。

2.3重組蛋白質(zhì)的大量表達(dá)及純化

根據(jù)小量制備的條件，進(jìn)行重組蛋白在大腸桿菌的大量制備。大量制備所得的包涵體經(jīng)過(guò)復(fù)性液復(fù)性后經(jīng)透析濾出中小分子雜質(zhì)。經(jīng)陽(yáng)離子交換層析柱純化后仍有少許大分子雜質(zhì)，所以行進(jìn)一步凝膠過(guò)濾純化(圖5)。

圖1小鼠Reg3γ基因PCR產(chǎn)物圖2重組質(zhì)粒 pET-30b(+)-圖3重組蛋白R(shí)eg3γ的小量制備。1、未加IPTG

瓊脂糖凝膠電泳，MW為Reg3γ基因酶切鑒定結(jié)誘導(dǎo)菌液 2、IPTG誘導(dǎo)后菌液 3、菌液離心

DNA分子marker。果，MW為DNA分子的上清液4、細(xì)菌經(jīng)超聲碎裂后的離心沉淀

marker。5、細(xì)菌碎裂后離心上清細(xì)菌裂解液上清。

M為蛋白質(zhì)marker。

圖4重組蛋白R(shí)eg3γ的小量制備條件。(a)IPTG圖5重組蛋白R(shí)eg3γ的表達(dá)和純化。1、未加IPTG誘導(dǎo)菌液

濃度對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響。1、未誘導(dǎo)菌液；2、IPTG誘導(dǎo)后菌液 3、超聲碎裂后離心上清4、包涵體經(jīng)

2、IPTG 0.2 mM/L；3、IPTG 0.5 mM/L；4 IPTG 研磨清洗后離心上清5、復(fù)性蛋白質(zhì)經(jīng)離子交換層析柱純

0.8 mM；(b)誘導(dǎo)時(shí)間對(duì)重組蛋白表達(dá)的影響。化后。M為蛋白質(zhì)marker。

1、未誘導(dǎo)菌液；2、誘導(dǎo)2小時(shí)；3、誘導(dǎo)4小時(shí)；

4、誘導(dǎo)6小時(shí)。

凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)分子大小和形狀的差異進(jìn)行分離的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。不同分子按照大小順序洗出，大分子先洗出，小分子后洗出。洗出的蛋白質(zhì)按濾出的順序分別存放在30個(gè)離心管中，如圖6所示除去重組蛋白中的大分子雜質(zhì)。

2.4重組蛋白的鑒定

經(jīng)純化的可溶性重組蛋白行SDS-PAGE，將凝膠中的蛋白質(zhì)電轉(zhuǎn)到PVDF膜上，再行免疫印記(Western-blotting)檢測(cè)。如圖7所示，在大小約為16 KD位置上出現(xiàn)了清晰的特異性條帶，表明重組蛋白R(shí)eg3γ能夠與相應(yīng)的特異性抗體結(jié)合，從免疫學(xué)上證明了Reg3γ重組蛋白表達(dá)的正確性。

3討論

越來(lái)越多的研究表明再生蛋白3在調(diào)節(jié)哺乳動(dòng)物腸道內(nèi)細(xì)菌和宿主之間的內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定具有重要的意義[1]。除了抗菌作用[2]外，再生蛋白3還參與多種類型細(xì)胞的增殖和分化，具有抗凋亡和促有絲分裂等作用，與糖尿病[3]、腫瘤[4]及炎性腸道病[5]等多種疾病相關(guān)。為通過(guò)小鼠動(dòng)物模型及體外深入研究再生蛋白3的功能及作用機(jī)制，本文利用生物工程技術(shù)在表達(dá)重組小鼠的Reg3γ蛋白質(zhì)。我們根據(jù)GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)提供的基因序列設(shè)計(jì)引物，PCR擴(kuò)增目的基因，將鼠Reg3γ基因插入pET-30b(+)質(zhì)粒成功構(gòu)建成重組質(zhì)粒pET-30b(+)-Reg3γ。

圖6重組蛋白R(shí)eg3γ經(jīng)凝膠過(guò)濾柱Sepharyl S-200R的純化。圖7重組蛋白R(shí)eg3γ的Western-blotting檢測(cè)。

M為蛋白質(zhì)marker。1、2為重組蛋白R(shí)eg3γ，3為陰性對(duì)照

許多情況下，在表達(dá)細(xì)菌中目的蛋白聚集成不溶的沒(méi)有生物活性的結(jié)構(gòu)，稱為包涵體。形成包涵體有利于通過(guò)離心收獲相對(duì)純凈的蛋白。目標(biāo)蛋白以無(wú)活性的包涵體形式表達(dá)，不會(huì)影響宿主菌的生長(zhǎng)。Reg3γ蛋白具有抗菌作用，如果直接表達(dá)可溶的活性蛋白可能會(huì)對(duì)宿主細(xì)菌產(chǎn)生影響。pET-30b(+)質(zhì)粒是適合表達(dá)包涵體的質(zhì)粒，非常適合制備再生蛋白3這樣的小蛋白。

本研究通過(guò)小量制備確定了重組Reg3γ蛋白在大腸桿菌中表達(dá)的適合條件：IPTG誘導(dǎo)濃度使用0.5 mM/L，誘導(dǎo)時(shí)間為6小時(shí)。小量制備結(jié)果顯示重組Reg3γ蛋白質(zhì)在大腸桿菌中表達(dá)形式是不溶的包涵體狀態(tài)，與實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)相符。變性溶解的包涵體通過(guò)透析析出小分子雜質(zhì)，經(jīng)離子交換層析初步純化。離子交換層析是根據(jù)蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)來(lái)進(jìn)行分離純化蛋白質(zhì)的方法。本實(shí)驗(yàn)中小鼠Reg3γ等電點(diǎn)為8.5，所以我們選擇使用陽(yáng)離子交換柱。經(jīng)陽(yáng)離子交換層析柱純化后仍有少許大分子雜質(zhì)，考慮為這兩種重組蛋白等電點(diǎn)接近中性，所以分離效果欠佳。凝膠過(guò)濾層析是根據(jù)分子大小和形狀的差異進(jìn)行分離的蛋白質(zhì)純化技術(shù)。不同分子按照大小順序洗出，大分子先洗出，小分子后洗出。本文重組蛋白R(shí)eg3γ經(jīng)凝膠過(guò)濾后，除去重組蛋白中的大分子雜質(zhì)，得到了純化的重組蛋白。純化的蛋白質(zhì)經(jīng)過(guò)Western-blotting檢測(cè)進(jìn)一步的到鑒定。我們進(jìn)一步還需要對(duì)重組蛋白的抗菌等功能進(jìn)行體外鑒定。

綜上，我們的工作為進(jìn)一步分析再生蛋白3的功能及作用機(jī)制提供了基礎(chǔ)。

參考文獻(xiàn)：

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(收稿日期：2015-11-14)

*通訊作者

基金項(xiàng)目：吉林省財(cái)政廳資助課題

文章編號(hào)：1007-4287(2016)04-0536-04