清腦止痛膠囊對硝酸甘油偏頭痛模型大鼠的影響機制

曲極冰，董秀華，閻　鑫，朱天全，曲　圓，孫申國，薛　歡，胡　楊，紀影實*

(1.吉林大學基礎醫學院 藥理學系，吉林 長春130021；2.長春中醫藥大學基礎醫學院；3.吉林敖東洮南藥業股份有限公司；4.吉林大學第二醫院 骨科)

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清腦止痛膠囊對硝酸甘油偏頭痛模型大鼠的影響機制

曲極冰1，董秀華2#，閻鑫1，朱天全3，曲圓4，孫申國3，薛歡1，胡楊1，紀影實1*

(1.吉林大學基礎醫學院 藥理學系，吉林 長春130021；2.長春中醫藥大學基礎醫學院；3.吉林敖東洮南藥業股份有限公司；4.吉林大學第二醫院 骨科)

摘要：目的探討清腦止痛膠囊(QNZTJN)對硝酸甘油致偏頭痛大鼠的影響。方法健康雄性Wistar大鼠90只，隨機分為6組:空白組、模型組、清腦止痛膠囊低(QNZTJN-L,0.35 g/kg)、中(QNZTJN-M,0.7 g/kg)、高(QNZTJN-H,1.4 g/kg)劑量組、陽性藥正天丸組(0.006 g/kg)，每組15只。給藥7天后，用皮下注射硝酸甘油(NTG,10 mg/kg)復制大鼠偏頭痛模型，觀察注射硝酸甘油后180 min內大鼠行為學反應，造模4 h后檢測血清及腦干中一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、5-羥色胺(5-HT)、降鈣素基因相關肽(CGRP)、β-內啡肽(β-EP)含量的變化。 結果與對照組比較，模型組大鼠撓頭次數明顯增加(P<0.05,P<0.01)，血漿和腦組織NO含量明顯升高(P<0.05,P<0.01)，腦組織中NOS、CGRP含量明顯升高(P<0.05)，β-EP、5-HT含量明顯降低(P<0.05)；與模型組比較，清腦止痛膠囊中、高劑量組大鼠撓頭次數明顯減少(P<0.05,P<0.01)，血漿和腦組織NO含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)，腦組織中NOS、CGRP含量明顯降低(P<0.05)，β-EP、5-HT含量明顯升高(P<0.05)，且呈劑量依賴性。結論清腦止痛膠囊可以緩解大鼠偏頭痛癥狀，其機制可能與調節單胺類神經遞質釋放，進而改善腦及血管的功能障礙有關。

關鍵詞：清腦止痛膠囊；偏頭痛；一氧化氮；一氧化氮合酶；降鈣素基因相關肽

(ChinJLabDiagn,2016,20:0529)

偏頭痛是反復發作的臨床常見病，呈一側或兩側疼痛，發作時常伴有惡心、嘔吐[1]。神經生化的代謝紊亂是形成偏頭痛的重要因素。研究發現偏頭痛與一氧化氮(NO)、5-羥色胺(5-HT)、降鈣素基因相關肽(CGRP)、β-內啡肽(β-EP)密切相關[2,3]。但迄今為止，尚無特效藥物。本實驗采用硝酸甘油致偏頭痛大鼠模型，觀察清腦止痛膠囊對偏頭痛的影響和作用機制。

1材料

1.1實驗動物

健康雄性Wistar大鼠90只，體重180 g-220 g，SPF級別，購自吉林大學實驗動物中心。

1.2藥品及試劑

清腦止痛膠囊由吉林敖東洮南藥業股份有限公司生產，正天丸由華潤三九醫藥股份有限公司生產；硝酸甘油注射液由河南潤弘制藥股份有限公司生產； NO試劑盒購自南京建成生物工程研究所；大鼠CGRP、β-EP和5-HT酶聯免疫檢測試劑盒購于安迪生物科技有限公司；NOS2購于艾博抗貿易有限公司；UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒(鼠)、DAB顯色試劑盒購于福州市邁新生物技術開發有限公司。

1.3方法

1.3.1分組健康雄性Wistar大鼠90只，適應性喂養一周后，隨機分為6組：空白組、模型組、清腦止痛膠囊低(QNZTJN-L)、中(QNZTJN-M)、高劑量組(QNZTJN-H)、正天丸組，每組15只。

1.3.2給藥大鼠于造模前預防性給藥7 d，灌胃高劑量清腦止痛膠囊1.4 g/kg、中劑量0.7 g/kg、低劑量0.35 g/kg，正天丸劑量為0.006 g/kg。空白組與模型組給予等量的蒸餾水。

1.3.3造模末次給藥60 min后，參照文獻[4,5]方法，除空白組給予生理鹽水外，各組分別于右肩皮下注射NTG 10 mg/kg。

1.3.4行為學評分以30 min為一個時間段， 觀察造模后大鼠在6個時間段中的撓頭次數。

1.3.5取材和標本處理大鼠皮下注射NTG 4 h 后，用10%水合氯醛麻醉，取血，分離血漿，然后斷頭取腦，其中10只在冰盒上分離出腦干，制備腦干組織勻漿液，4℃下離心15 min(3 500 r/min)，取上清保存，余5只取腦固定于10%甲醛備用。

1.3.6生化指標檢測檢測大鼠血漿及腦組織中NO含量，采用酶聯免疫法檢測大鼠腦組織中CGRP、β-EP、5-HT的含量。

1.3.7免疫組化檢測將甲醛固定的腦組織脫水后常規石蠟包埋。將切片脫蠟、脫水，于0.01%枸櫞酸緩沖液中抗原修復后，按UltraSensitiveTMS-P超敏試劑盒(鼠)說明進行免疫組化染色。光鏡400 倍視野下觀察，在每一張切片的中腦導水管周圍灰質區隨機取5個點，用 Image Pro Plus 6.0 圖像分析系統對切片陽性區域表達部分進行平均光密度值測定。

2結果

2.1清腦止痛膠囊對偏頭痛大鼠行為的影響

模型組大鼠撓頭次數在注射硝酸甘油后30-60min達到最高峰，150-180min左右消失，與對照組比較，模型組大鼠撓頭次數明顯增加(P<0.05, P<0.01)；與模型組比較，清腦止痛膠囊組大鼠撓頭次數隨著給藥劑量的升高依次降低，且中劑量與高劑量組與模型組比較差異具有統計學意義(P<0.05, P<0.01)。見表1。

表1　清腦止痛膠囊對偏頭痛模型大鼠撓頭次數的影響±s，n=10)

模型組與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；各藥物組與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

2.2清腦止痛膠囊對偏頭痛大鼠血漿及腦組織中NO含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠血漿及腦組織中NO的含量升高(P<0.05,P<0.01)；與模型組比較，清腦止痛膠囊中、高劑量組大鼠血漿及腦組織中NO的含量明顯降低(P<0.05,P<0.01)，且呈一定劑量依賴性。見表2。

表2　　　　清腦止痛膠囊對偏頭痛大鼠模型血清、腦組織中

模型組與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；各藥物組與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

2.3清腦止痛膠囊對偏頭痛大鼠腦組織中NOS含量的影響

與對照組比較，模型組NOS陽性細胞表達增加；與模型組比較，清腦止痛膠囊中、高劑量組大鼠腦組織中NOS陽性細胞表達明顯降低(P<0.05,P<0.01)，且呈劑量依賴性。見圖1。

與空白組比較，*P<0.05，**P<0.01；與模型組比較#P<0.05，##P<0.01

圖1免疫組化染色大鼠中腦導水管周圍灰質區

NOS2蛋白表達(400×)

2.4清腦止痛膠囊對偏頭痛模型大鼠腦組織β-EP、CGRP、5-HT含量的影響

與對照組比較，模型組大鼠腦組織中CGRP含量增加(P<0.05)，β-EP與5-HT含量降低(P<0.05)；與模型組比較，清腦止痛膠囊高劑量組大鼠腦組織5-HT含量明顯升高(P<0.05)，清腦止痛膠囊中、高劑量組大鼠腦組織CGRP含量明顯降低、β-EP含量明顯升高(P<0.05)，呈一定劑量依賴性。見表3。

組別數量劑量β-EP含量(pg/mg)5-HT含量(ng/mg)CGRP含量(pg/g)空白組10—1.27±0.095.05±0.83217.68±15.73模型組10—0.85±0.07*3.66±0.30*408.81±59.38*正天丸組100.006g/kg1.12±0.10#4.47±0.40235.29±6.24#QNZTJN-L100.35g/kg0.94±0.073.89±0.20377.11±50.48QNZTJN-M100.7g/kg1.06±0.14#4.32±0.79338.02±54.28#QNZTJN-H101.4g/kg1.14±0.09#4.77±0.46#232.55±7.22#

模型組與空白組比較，*P<0.05；各藥物組與模型組比較#P<0.05

3討論

治療偏頭痛的的藥物很多，但尚無特效藥。西醫以鎮靜止痛對癥治療為主，多數治標不治本；中醫藥因其辯證施治，對偏頭痛治療有明顯的優勢。清腦止痛膠囊由天麻、蒺藜、川芎、枸杞子、牛膝、香附、丹參、熟地黃、藁本、細辛組成。主治祛風清腦，化瘀止痛。用于普通型偏頭痛肝風夾瘀證。研究表明天麻對中樞神經系統的作用突出，具有明顯的鎮靜催眠作用，還可以擴張血管，改善血管收縮功能及舒張功能，緩解偏頭痛[6,7]。川芎是治療偏頭痛的常用藥物，已有研究表明川芎能夠明顯抑制偏頭痛大鼠硬腦膜血管因硝酸甘油引起的擴張反應[8,9]。

硝酸甘油(NTG)，能誘導細胞產生一氧化氮(NO)、一氧化氮合酶(NOS)、環磷酸鳥苷酸(CGMP)等擴血管物質[10,11]。NTG誘發偏頭痛模型大鼠的行為表現為耳紅、爬籠、撓頭，本實驗發現注射NTG 5 min左右大鼠出現撓頭反應，30-60 min 達到最高峰，150-180 min左右消失，清腦止痛膠囊組大鼠撓頭次數得到有效緩解，療效呈劑量相關性。清腦止痛膠囊能緩解偏頭痛模型大鼠的頭痛癥狀。

NO作為特殊的神經遞質已被廣泛關注，兼有神經遞質和效應分子的雙層功效。NO通過激活平滑肌中鳥苷酸環化酶, 使細胞內產生大量的cGMP, 從而激活cGMP 依賴的蛋白酶, 后者使肌球蛋白輕鏈去磷酸化, 并降低細胞內游離鈣水平, 使收縮蛋白與Ca2+結合減少導致血管舒張, 引起頭痛；同時NO 可引起血管周圍神經纖維CGRP、SP、NKA等血管活性物質的釋放，增加硬膜細胞因子和誘導型NOS的表達,直接或間接引起神經源性血管擴張，參與偏頭痛的發作[12]。本實驗研究結果顯示硝酸甘油造模偏頭痛大鼠血清與腦干中NO含量均顯著升高，且腦干中NOS表達升高。

CGRP是多功能神經肽，是迄今為止體內最強的舒血管活性物質，它在疼痛感覺調控中也發揮重要作用，過量釋放和由它產生的神經炎癥被認為是偏頭痛的病理生理基礎[13]。偏頭痛患者在發作時其頸外靜脈血的CGRP 明顯升高，用CGRP 受體拮抗劑治療可使患者的頭痛得到緩解及靜脈血的CGRP 恢復正常[14,15]。本研究結果顯示硝酸甘油注射劑制備的偏頭痛大鼠腦干中CGRP含量升高，清腦止痛膠囊給藥組大鼠腦干中CGRP含量明顯降低。近年研究發現偏頭痛與內源性阿片肽系統的障礙密切相關，β-EP 是體內鎮痛系統的主要遞質， 具有嗎啡樣的鎮痛作用。β-EP 的減少對腦干藍斑的抑制減弱， 使多種血管活性物質釋放， 導致腦血管舒縮功能紊亂，進而促使偏頭痛發作[16]。本實驗研究結果顯示模型組偏頭痛大鼠腦干中β-EP含量降低，而清腦止痛膠囊可顯著增加其含量。

5-HT是受體和靶細胞的介導物質，產生的生物效應，導致偏頭痛，認為5-HT是偏頭痛發病的重要因素，目前很多偏頭痛藥物都是通過5-HT起作用的[17]。 Nagata等報道偏頭痛患者在其頭痛發作時血中的 5-HT明顯減少，付秋菊等發現硝酸甘油型偏頭痛大鼠血清5-HT水平明顯下降，且研究發現 5-HT 耗竭劑利血平可誘發偏頭痛 ,使實驗動物血及腦內 5-HT 含量明顯下降[18]。本實驗結果發現,與正常大鼠比較, 硝酸甘油型偏頭痛大鼠腦5-HT含量降低,給予清腦止痛膠囊, 能夠增加腦組織中5-HT 含量。

綜上，本實驗結果表明清腦止痛膠囊可使由NTG誘發的偏頭痛模型大鼠腦中 NO、NOS、CGRP 大量生成水平降低，使 β-EP、5-HT大量減少水平升高，從而升高鎮痛系統的遞質含量、改善腦及血管的功能障礙使之趨于生理狀態下的平衡水平，以緩解偏頭痛癥狀。

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Effect of QNZTJN on Migraine in rats induced by nitroglycerin

QUJi-bing,DONGXiu-hua,YANXin,etal.

(DepartmentofPharmacology,CollegeofBasicMedicalScience,JilinUniversity,Changchun130021,China)

Abstract:ObjectiveTo observe the effect of QNZTJN on rats model of migraine induced by nitroglycerin.MethodsTotally 90 Wistar rats (males) were randomly divided into 6 groups: Control group, QNZTJN low dose gourp (0.35 g/kg), QNZTJN medium dose group (0.75g/kg), QNZTJN high dose group (1.4 g/kg), ZTW group(0.006 g/kg).The migraine models were induced by injecting 10 mg/kg nitroglycerin into the rats to observe the effects of different concentrations of QNZTJN on the level of NO, NOS, 5-HT, CGRP, β-EP in the brain tissue and plasma.ResultsCompared with the normal group, the forelimb scratching frequency of rats were increased significantly in model group(P<0.05,P<0.01),the content of NO in both brain and serum was increased(P<0.05,P<0.01), the contents of CGRP and NOS in brain were increased (P<0.05) , but the contents of β-EP and 5-HT in the brain were decreased significantly(P<0.05,P<0.01).Compared with model group, QNZTJN medium and high dose groups significantly reduced the forelimb scratching frequency of rats(P<0.05,P<0.01), the content of NO in both brain stem and serum was decreased(P<0.05,P<0.01), the contents of CGRP and NOS were decreased(P<0.05) , but the contents of β-EP and 5-HT in the brain stem were increased(P<0.05,P<0.01).These effects were in a dose dependent manner.ConclusionThe QNZTJN can relieve migraine attacks, which may regulate the release of monoamine neurotransmitters,thus improving the function of the brain and vascular disorders.

Key words:QNZTJN; migraine; nitric oxide; nitric oxide synthase; calcitonin generelatiod peptide

(收稿日期：2015-08-24)

中圖分類號：R747.2

文獻標識碼：A

*通訊作者

基金項目：吉林省科技廳項目基金支持(20140310001YY)

文章編號：1007-4287(2016)04-0529-04

# 共同第一作者