電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬內(nèi)白介素-1β及轉(zhuǎn)錄核因子κB抑制蛋白激酶的影響

姜立剛，李　雪，李海平，劉立峰

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,吉林 吉林132011；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

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電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬內(nèi)白介素-1β及轉(zhuǎn)錄核因子κB抑制蛋白激酶的影響

姜立剛1，李雪1，李海平1，劉立峰2*

(1.北華大學(xué)附屬醫(yī)院 神經(jīng)內(nèi)科,吉林 吉林132011；2.北華大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院)

摘要：目的研究分析電針對(duì)局灶性腦缺血再灌注大鼠海馬內(nèi)白介素-1β和轉(zhuǎn)錄核因子κB抑制蛋白激酶的影響。方法將210只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組，分別為60例、75例和75例，灌注后每組根據(jù)12 h、24 h和48 h再分為三組。對(duì)比各組IL-1β含量和IKKβ的蛋白表達(dá)水平。結(jié)果模型組各組海馬中IL-1β含量均顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針各組海馬中IL-1β含量均顯著低于模型各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。模型各組IKKβ蛋白水平均顯著高于假手術(shù)各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針各組IKKβ蛋白水平均顯低于模型各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。結(jié)論大鼠局灶性腦缺血再灌注損傷后會(huì)出現(xiàn)炎性反應(yīng)，給予電針干預(yù)后可顯著降低IL-1β含量和IKKβ的蛋白表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。

關(guān)鍵詞：電針；白介素-1β；轉(zhuǎn)錄核因子κB抑制蛋白激酶

(ChinJLabDiagn,2016,20:0523)

轉(zhuǎn)錄核因子κB抑制蛋白激酶(IKKβ)是核因子κB信號(hào)通路上游關(guān)鍵的IκB激酶，IKKβ的激活會(huì)直接影響到炎性反應(yīng)的激活[1]。研究顯示，電針對(duì)于局灶性腦缺血再灌注具有顯著臨床療效[2]。本研究使用SD雄性大鼠，觀察局灶性腦缺血再灌注損傷后海馬區(qū)內(nèi)IKKβ的蛋白表達(dá)情況和使用電針后對(duì)于IKKβ的影響情況，從而探究電針對(duì)于局灶性腦缺血再灌注后海馬區(qū)內(nèi)炎性損傷的調(diào)節(jié)效果。

1資料與方法

1.1一般資料將210只SD雄性大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組和電針組，分別為60例、75例和75例，灌注后每組根據(jù)12 h、24 h和48 h再分為三組。所有SD大鼠均為雄性清潔級(jí)，體質(zhì)量為280-300 g。大鼠可以自由進(jìn)食和飲水，在造模前禁食12 h，所有SD大鼠的處置均通過動(dòng)物倫理委員會(huì)認(rèn)可。

1.2方法

1.2.1電針方法選擇大鼠的“百會(huì)”穴和左側(cè)“四關(guān)”穴作為進(jìn)針穴位。“百會(huì)”穴連接電針方法：一側(cè)電極通過“百會(huì)”穴位上的針灸針，與其形成環(huán)路的另一電極包濕紗布，固定在右側(cè)后肢部位。“百會(huì)”穴平刺0.1cm，“四關(guān)”穴直刺0.2 cm，進(jìn)針后連接至電針治療儀。刺激參數(shù)：疏密波，頻率為2 Hz/100 Hz，強(qiáng)度為1 mA，刺激20 min。在缺血2 h后拔出栓子再灌注，即時(shí)進(jìn)行電針治療。電針12 h組在灌注后12 h處死大鼠前30 min進(jìn)行電針治療，總共進(jìn)行兩次電針刺激；電針24 h組分別在拔出栓子時(shí)、再灌注后12 h以及再灌注后24 h處死大鼠前30 min進(jìn)行電針刺激，共進(jìn)行三次電針刺激；電針48 h組分別在拔出栓子、再灌注后12 h、24 h以及再灌注后48 h處死大鼠前30 min進(jìn)行電針刺激，共進(jìn)行四次電針刺激。假手術(shù)組和模型組不給予電針刺激。

1.2.2樣本取材處理方法所有大鼠在各個(gè)觀察時(shí)間點(diǎn)時(shí)使用3.5%水合氯醛進(jìn)行腹腔麻醉注射。斷頭取右側(cè)海馬組織，然后快速放入-80℃冰箱中冷凍存儲(chǔ)。然后V型剪開大鼠肋骨，暴露心臟后使用生理鹽水+4%多聚甲醛經(jīng)心尖灌流固定住大腦組織，然后取出包埋、切片以做免疫化驗(yàn)備用。

1.2.3IL-1β水平測(cè)定方法在生理鹽水中加比例為100∶1的蛋白酶抑制劑，再將準(zhǔn)備好的海馬組織剝離后放入預(yù)冷玻璃勻漿器中充分研磨，然后放入離心機(jī)中離心，離心速度為2 000 r/min，時(shí)間為15 min，取出上清作為標(biāo)本備用。

1.2.4IKKβ蛋白檢測(cè)方法將石蠟切片(約4 μm厚)放置于二甲苯及梯度乙醇中進(jìn)行浸泡處理，在3%的雙氧水溫室中放置5-10 min孵育。確保維持98℃抗原修復(fù)半小時(shí)左右，再進(jìn)行20分鐘的血清封閉，調(diào)節(jié)稀釋濃度為1∶50，進(jìn)行孵育一抗IKKβ；再將PBS取代一抗作為陰性對(duì)照組，將其放置在4℃冰箱內(nèi)過夜。此外，應(yīng)注意37℃烤箱復(fù)溫60 min左右，添加DAB和二抗顯色試劑，進(jìn)行蘇木子復(fù)染處理，再進(jìn)行脫水-透明-封片處理。密切觀察每個(gè)切片上的5個(gè)高倍視野，記錄陽性細(xì)胞吸光度值情況。

2結(jié)果

2.1各組干預(yù)后海馬內(nèi)IL-1β含量比較假手術(shù)12h組、24h組和48h組海馬中IL-1β含量均為0.2ng/ml；模型12h組、24h組和48h組海馬中IL-1β含量為1.6ng/ml、1.7ng/ml和1.8ng/ml；電針12h組、24h組和48h組海馬中IL-1β含量為1.2ng/mL、1.0ng/ml和1.1ng/ml。模型組各組海馬中IL-1β含量均顯著高于假手術(shù)組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針各組海馬中IL-1β含量均顯著低于模型各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。詳見表1。

2.2各組干預(yù)后海馬內(nèi)IKKβ蛋白水平比較假手術(shù)12h組、24組和48組的平均吸光度值為0.15、0.14和0.16；模型12h組、24h組和48h組的平均吸光度值為0.35、0.40和0.44；電針12h組、24h組和48h組的平均吸光度值為0.20、0.20和0.22。模型各組IKKβ蛋白水平均顯著高于假手術(shù)各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針各組IKKβ蛋白水平均顯低于模型各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。見表1。

表1　　　　各組干預(yù)后海馬內(nèi)IL-1β含量及IKKβ蛋白

注：*與假手術(shù)組相比，P<0.05；△與模型各組相比，P<0.05

3討論

目前已有大量研究證實(shí)電針可顯著抑制缺血后出現(xiàn)的炎性反應(yīng)，并且能夠顯著改善機(jī)體免疫能力[3]。IL-1β是在免疫活性細(xì)胞激活后出現(xiàn)的免疫調(diào)節(jié)因子，其能夠顯著改善炎癥給機(jī)體組織帶來的損傷，但是如果出現(xiàn)過量IL-1β就會(huì)導(dǎo)致炎性對(duì)機(jī)體組織的損傷程度加重[4,5]。IL-1β在腦部中的神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞中產(chǎn)生，能夠在各個(gè)環(huán)節(jié)參與神經(jīng)元的損傷。并且在腦缺血再灌注損傷中，其能夠有效激活NF-κB從而誘導(dǎo)炎性反應(yīng)發(fā)生[6]。在本研究結(jié)果中可見，模型組各組海馬中IL-1β含量均顯著高于假手術(shù)組，差異顯著(P<0.05)；電針各組海馬中IL-1β含量均顯著低于模型各組，差異顯著(P<0.05)。說明電針治療后能夠顯著降低炎性因子水平。

NF-κB信號(hào)通路是炎性反應(yīng)中最為關(guān)鍵的部分，IL-1β是活化IKKβ信號(hào)通路產(chǎn)生炎性反應(yīng)的發(fā)生和發(fā)展的重要激酶[7，8]。所以有效降低IKKβ的活性可顯著阻礙NF-κB的激活，從而起到阻礙炎性反應(yīng)發(fā)生的作用[8]。在本研究中，模型各組IKKβ蛋白水平均顯著高于假手術(shù)各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；電針各組IKKβ蛋白水平均顯低于模型各組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。與秦文熠[9]等研究結(jié)果相類似。可見在給予電針治療后能夠顯著降低IKKβ蛋白水平，進(jìn)而降低IKKβ在NF-κB信號(hào)通路中的激活作用，最終起到抑制炎性反應(yīng)的目的。

綜上所述，在對(duì)于大鼠進(jìn)行局灶性腦缺血再灌注損傷后會(huì)出現(xiàn)炎性反應(yīng)，給予電針干預(yù)后可顯著降低IL-1β含量和IKKβ的蛋白表達(dá)，進(jìn)而減輕炎癥反應(yīng)。

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Influence of interleukin- β and nhibitorkappa B protein kinase of focal cerebral ischemia hippocampus of rat by electric-needle

JIANGLi-gang，LIXue，LIHai-ping，etal.

(DepartmentofNeurology，AffiliatedHospitalofBeihuaUniversity，Jilin132011，China)

Abstract:ObjectiveTo research and analyse the Influence of interleukin- β and nhibitorkappa B protein kinase of focal cerebral ischemia hippocampus of rat by electric-needle.MethodsTo select 210 male SD rats and randomly divided into the sham-operation group,model group and electric-needle group,they are 60 cases,75 cases and 75 cases.After priming,to divided into three groups as per 12 h,24 h and 48 h.To compared the IL-1β content and protein expression level of IKKβ of them.ResultsThe IL-1β content of the model groups was significantly greater than the sham-operation groups,there was statistical significance (P<0.05).The IL-1βcontent of hippocampus of the electric-needle groups was significantly lower than the model groups,there was statistical significance (P<0.05).The protein expression level of IKKβ of the model groups was significantly lower than the sham-operation group,there was statistical significance (P<0.05).The protein expression level of IKKβ of the electric-needle groups was significantly lower than the model groups,there was statistical significance (P<0.05).ConclusionThat will caused the inflammatory reaction by focal cerebral ischemia hippocampus of rat,and then given the electric-needle for intervening that can help significant decrease the IL-1β content and protein expression level of IKKβ and to help alleviating the inflammatory response.

Key words:Electric-needle;Interleukin-1β;Nhibitorkappa B protein kinase

(收稿日期：2015-07-13)

中圖分類號(hào)：R743

文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

*通訊作者

基金項(xiàng)目：吉林省衛(wèi)生廳科研項(xiàng)目(2012Z102);吉林省教育廳“十二五”科學(xué)技術(shù)研究項(xiàng)目(吉教科合字2013-441)

文章編號(hào)：1007-4287(2016)04-0523-03