銅綠假單胞菌群體感應效應系統細菌毒力調節的研究進展

陳雙紅，陳銳勇，徐雄利，肖衛兵

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·綜述與講座·

銅綠假單胞菌群體感應效應系統細菌毒力調節的研究進展

陳雙紅，陳銳勇，徐雄利，肖衛兵

[關鍵詞]銅綠假單胞菌；群體感應系統；感染；適應性

銅綠假單胞菌分布廣，發病率、致死率高，是院內感染的第三大病原。銅綠假單胞菌有超過10%的基因組動態多變，隨環境改變展示極強的種群遺傳進化功能，以使其適應不同生長環境[1-2]。其中，群體感應效應(quorum-sensing, QS)系統是其種內及種間相互交流、并完成生物學特性適應性表達的關鍵基因族群。QS系統接受環境信號激活后可調節銅綠假單胞菌300多個毒力基因，包括：細菌生長、運動、鞭毛形成、分泌系統、生物被膜形成因子及參與細菌與宿主間的相互作用等關鍵致病環節。另外，QS系統調節生物被膜形成是銅綠假單胞菌臨床頑固性耐藥菌株產生的主要原因[3]。故，銅綠假單胞菌QS系統調節效應，與細菌致病和宿主逃避等行為密切相關，一直是臨床細菌抗感染研究的熱點[4-5]。

1銅綠假單胞菌QS系統組成

銅綠假單胞菌的QS系統是一個依賴于種群內細胞密度而被激活的基因調控系統，通過產生自誘導復合調節子調控下游靶基因，實現種群環境適應性生存。迄今認為，銅綠假單胞菌QS系統至少包括三套子系統，即AHL(N-acylated homoserine lactones，AHLs)信號依賴系統：las系統，rhl系統；AQ信號依賴的PQS系統[4-5](圖1)。

圖1　環境信號觸發銅綠假單胞菌QS系統響應的級聯調控示意圖

1.1AHL信號依賴的QS系統QS系統的核心子系統是AHL信號依賴的las/rhl系統[2，6-7]。las系統由lasI、lasR和信號分子3OC12-HSL(N-3-oxo-dodecanoyl-homoserine lactone, 3OC12-HSL)構成，rhl系統由rhlI、rhlR和信號分子C4-HSL(N-butanoyl-homoserine lactone, C4-HSL)構成。在las/rhl系統中I基因編碼合成酶I蛋白，催化酰基載體蛋白酰基側鏈與S-腺苷蛋氨酸高絲氨酸側鏈生成AHL信號分子。AHL信號分子細胞外濃度達到一定，進入細胞內與R基因編碼的R蛋白結合形成復合調節子，啟動對下游靶基因的調控。lasR/3OC12-HSL復合子主要調節堿性蛋白酶、外毒素A、彈性蛋白酶等細胞主要急性毒力因子的基因轉錄表達；rhlR/ C4-HSL復合子則指導鼠李糖脂溶血素、幾丁質酶、氰化物、綠膿菌素等細胞外次級代謝物質的產生，其調節作用滯后于lasR/3OC12-HSL復合子。

1.2AHQ信號依賴的QS系統喹諾酮類[2-alkyl-4(1H)-quinolone, AHQ]信號分子系統，是近期發現的銅綠假單胞菌第三套QS系統。由Pqs操縱子基因pqsABCDEH的產物指導細胞中的鄰氨基苯甲酸合成4-羥基-2庚基-喹諾酮(4-hydroxy-2-heptylquinoli ne，HHQ)分子，同時該操縱子受轉錄調節子PqsR調控以維持信號分子的生理穩定性。PQS信號分子是由加單氧化酶催化HHQ生成，該酶的生成受pqsH操縱子產物調節，從而進一步調控PQS信號分子水平。PqsR/PQS復合調節子的主要功能是調節細菌密度及毒力因子釋放相關基因的功能[2,6-7]。

1.3其他信號分子依賴的QS系統除外AHL和AHQ信號依賴QS系統，近年來還有報道將GacS/GacA系統作為銅綠假單胞菌QS的另一種輔助系統[2-3]。該系統的具體構成和調控機制尚待明確，但已證明其能夠提高細菌運動能力、釋放可可堿醋酸鈉、促進生物被膜形成。

2銅綠假單胞QS系統調節

2.1QS系統內的級聯調節銅綠假單胞菌QS系統內存在嚴格的等級分層調控，las系統位于QS系統內級聯調節的最上游。lasR/3OC12-HSL調節子正反饋調節lasI,rhlI和rhlR的基因表達。同時，細胞內存在由RsaL蛋白介導的負反饋回路，調節lasR/3OC12-HSL的功能。亦即，通過RsaL轉錄調節抑制子與rsaL-lasI雙向啟動子結合抑制lasI基因轉錄，使細胞中3OC12-HSL維持穩態水平，進而維持lasR/3OC12-HSL復合調節子正反饋回路的平衡穩定性。RsaL與lasR/3OC12-HSL調節子在rsaL-lasI雙向啟動子DNA序列上的結合位點是毗鄰而非競爭性，且RsaL調節子活性優先于lasR/3OC12-HSL的激活調節。不僅如此，RsaL還直接與QS系統調節的下游毒力基因(如：綠膿菌素等)的啟動子區域結合，可直接調節毒力基因的功能[2-3，8-11]。

另外，las系統同時參與調節PQS系統，其中lasR/3OC12-HSL調節子激活pqsH操縱子功能，促進HHQ向PQS信號分子的轉化，同時AHQ系統中的pqsABCD和PqsR的轉錄活性受rhlR/C4-HSL復合調節子的抑制。從而PQS系統信號分子的合成受las和rhl控制，同時PQS信號分子濃度影響las和rhl系統的基因表達，兩者之間存在精細生理學平衡關系。這一序貫性級聯調節決定las/rhl系統在銅綠假單胞菌QS系統的看家基因(home gene)地位，從而是其環境適應和調節的中心環節[4-5,8-14]。

2.2細菌全局調控因子對QS系統的調節除外QS系統內自反饋調節，銅綠假單胞菌QS系統還受細菌內源性全局調控因子的調節[14]。GacA被認為是QS系統最重要的全局調控因子，GacA蛋白正調控lasR和rhlR啟動子；全局轉錄調節因子AlgR2則與lasR和rhlR啟動子區結合，負向調節lasR和rhlR的轉錄活性；cAMP受體蛋白家族成員之一的Vfr蛋白，是細菌能量代謝和生長活性狀態的感應因子，直接參與lasR基因的表達調控，也部分參與rhlR基因的活性調節。lasI基因的表達和轉錄水平分別受Vfr蛋白和rsaL的調節影響。ppK基因編碼的多聚磷酸激酶正向調節QS信號分子3OC12-HSL和C4-HSL合成，轉錄起始因子σ家族的RpoN和RpoS對維持細胞內子3OC12-HSL和C4-HSL水平的穩定性有重要作用。同時，全局調節因子GacA還調節著另外2個與LuxR同源的R蛋白QscR 和 VqsR的合成。QscR蛋白不僅能抑制lasI基因轉錄水平，而且在AHLs信號分子缺失情況下,通過形成同源多聚體或與lasR和rhlR蛋白形成異源二聚體對QS系統進行精細調節，其調節功能與其他內源性性調節子的調節功能協調統一。研究還表明，在AHLs基因缺失細胞中，如果同時沉默VqsR基因功能，可以大大降低銅綠假單胞菌內毒力因子水平及其致病性，亦即VqsR參與了QS系統及其下游基因的調節功能。

細胞內參與調節QS系統的額外調節因子大致可分為3類：①正調控因子：GacA，Vfr和DksA等。②負調控因子：AlgR2,MvaT,RsmA和QscR等。③雙向調節因子：VqsR，RpoN，RpoS等。這些額外調節因子既參與QS系統調節，又參與銅綠假單胞菌生物學功能中其他基因的調節作用，同時這些額外調節因子幾乎都是環境刺激感應因子。正是這一調節特點使得銅綠假單胞菌能在不同環境刺激中激活不同的QS精細調節通路以表達特定的基因，實現對環境的適應性生長表型，從而得以在自然界中廣泛存在[4-5,8-14]。

3銅綠假單胞菌QS系統與感染環境適應性調節

環境刺激誘導QS系統響應是銅綠假單胞菌間進行種內交流并完成生物特性適應性表達的關鍵步驟。該系統接受環境信號刺激并激活調節銅綠假單胞菌10%以上的有效基因，主要包括毒力、生物膜形成、鞭毛運動、細菌與宿主間的相互作用等關鍵致病環節因子，最終實現利于細菌種群侵襲、定植、免疫逃避和耐藥性產生的有益生長表型。正是基于QS系統介導臨床特殊生理環境中銅綠假單胞菌感染適應性中的重要作用，近年來其已成為國際研究和關注的熱點。銅綠假單胞菌對環境適應性調節研究最為透徹的是侵入臨床CF患者并能迅速適應CF患者肺部環境，完成急性感染到慢性遷延性感染的轉變。由于慢性適應性感染的病菌無一例外都是頑固耐藥菌，合并銅綠假單胞菌感染已成為CF患者院內死亡的主要原因[1,3-4]。

CF患者臨床不同感染期，銅綠假單胞菌毒力基因表達差異明顯，而這一差異主要是由細菌在不同感染期維持種群適應性生長進化需求決定(圖2)[2]。在急性感染侵襲期細菌需要快速生長、侵入并定植于宿主。因此，環境信號主要誘導細菌感應系統激活與侵襲相關的毒力基因(如:toxA,aprA，phzA1)、與生長定植相關的基因(如：鞭毛運動)、與逃避宿主防御功能相關基因(如：TypeⅢ分泌系統)等的大量表達，以適應細菌快速侵染定植的生長需要。慢性感染的臨床患者分離株中，銅綠假單胞菌的細胞外分泌產物明顯減少，TypeⅢ分泌系統功能失活，與侵襲相關的脂多糖被代之以與生物膜形成相關的表多糖，與細菌黏液樣生長表型密切相關的藻酸鹽過量表達。銅綠假單胞菌細胞外一旦產生大量的藻酸鹽，則可形成生物膜包圍細胞使其免遭機體巨噬細胞的吞噬，生物膜形成是細菌慢性感染和耐藥性產生的重要基礎。這些在急性感染期高表達的毒力基因出現表達抑制，甚至高頻失活性序列突變等是為適應缺氧、免疫鈍化和抗生素治療壓力等CF慢性感染環境。急慢性環境刺激誘導銅綠假單胞菌的適應調節機制主要有兩方面：直接的信號感應激發精細的信號轉導調節，持續選擇壓力誘導基因遺傳變異的適應調節[11-12]。

圖2　銅綠假單胞菌細胞急慢性毒力因子感染適應性

在持續的環境選擇壓力下，QS系統及其調節因子的基因組遺傳信息改變是其對環境有效適應的另一途徑。 Smith對臨床急慢性感染的銅綠假單胞菌分離株進行比較基因組學研究發現，慢性感染分離株基因組發生大量的基因突變。基因突變的特點是以單堿基改變、1～3個堿基的插入或丟失居多，少數也出現大片段基因缺失，從而出現相應基因編碼蛋白翻譯的提前終止、讀碼框移位、轉座子插入等。這種自然環境選擇下的非同義突變中約有2/3以上是陽性選擇性突變，直接導致了相應蛋白功能的部分或全部丟失。通過對感染早期和感染96個月的分離株的比較發現，感染晚期分離株基因突變發生率最高的是QS效應系統基因，其次突變基因涉及菌體抗原合成、III型分泌因子、細菌顫動、外毒素A調節、多藥耐藥泵、滲透壓平衡和離子獲取等基因，這些基因型的改變都減低了細菌在急性感染期的毒性表型，也進一步證明這些表型的改變是為適應CF慢性感染的缺氧、免疫鈍化和抗生素治療的環境選擇壓力[13-14]。

其中QS系統的lasR基因突變頻率最高。研究表明：在對CF慢性感染環境適應過程中，lasR基因的突變至少出現3種有益于種群內和種群間的生長效應：①減少lasR/ 3OC12-HSL復合調節子對急性侵襲因子的誘導表達，逃避宿主細胞對細菌的免疫識別；②減少對lasI基因表達的誘導功能，通過減少細胞自感應分子生成，控制局部種群生長密度以減少生長信息感知。③lasR基因自身功能完全缺失，對細胞外種群間效應分子無反應(signal blind)，出現種群間的隱身欺騙效應，以維持種內生長適應要求。除外lasR基因的高頻突變外，臨床頑固性感染株基因組還檢測到rhlR和lasI基因突變，lasR基因上游的全局調控因子Vfr基因突變頻率也很高。更有意義的是，在QS系統及其調節子高頻突變的菌株中，往往同時伴有Muts基因的突變，Muts基因是銅綠假單胞菌基因組中DNA堿基錯配修復基因。其基因突變導致的修復功能缺失，可維持特定環境下細菌自體基因組序列遺傳學適應性穩定，從而QS及相關毒力基因環境選擇性基因高頻突變效率得以選擇性維持[8,12]。

因此，細胞生存環境的外源信號一方面通過跨膜的信號感知系統激活下游的全局調控因子，幾乎都參與調節QS系統功能，通過激活或抑制QS系統功能進一步精細調控下游毒力基因的表達，實現銅綠假單胞菌對臨床急慢性感染環境的適應性；另一方面慢性環境信號的選擇壓力還可以通過改變信號通路中看家基因的遺傳信息實現細菌對環境的定向適應性調節。總之，感染環境誘導銅綠假單胞菌QS系統對毒力的調節作用使細菌在宿主中實現了 “費用-效益” 最優化的種群生存法則。

4結語

綜上所述，諸多的環境選擇壓力可激活銅綠假單胞菌QS調節系統，由其再進一步定向介導下游有效毒力基因表達，使銅綠假單胞菌出現強大“環境-細菌-宿主”的生存適應表型，最終實現存活的“費用-效益”最優化的種群生長法則。正是基于此，筆者認為銅綠假單胞菌在氦氧飽和高氣壓環境中出現快速增殖并對健康人群表現出高侵害表型，也可能是QS系統對該環境暴露的敏感響應能力誘導調控下游基因所致[6]。如能準確詮釋這一調控機制，闡明銅綠假單胞菌潛水職業性高感染的原因，將對研究新的抗感染治療技術手段、控制該職業領域感染高發有重要意義。

[參考文獻]

[1]Hassett DJ, Sutton MD, Schurr MJ, et al. Pseudomonas aeruginosa hypoxic or anaerobic biofilm infections within cystic fibrosis airways[J]. Trends Microbiol, 2009, 17(3): 130-138.DOI:10.1016/j.tim.2008.12.003.

[2]Nguyen D, Singh PK. Evolving stealth: genetic adaptation of Pseudomonas aeruginosa during cystic fibrosis infections[J]. Proc Natl Aced Sci USA, 2006, 103(22): 8305-8306.DOI:10.1073/pnas.0602526103.

[3]Darch SE, West SA, Winzer K, et al. Density-dependent fitness benefits in quorum-sensing bacterial populations[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2012, 109(21): 8259-8263.DOI: 10.1073/pnas.1118131109.

[4]Williams P, Cmara M. Quorum sensing and environmental adaptation in Pseudomonas aeruginosa: a tale of regulatory networks and multifunctional signal molecules[J]. Curr Opin Microbiol, 2009, 12(2): 182-191.DOI:10.1016/j.mib.2009.01.005.

[5]Verstraeten N, Braeken K, Debkumari B, et al. Living on a surface: swarming and biofilm formation[J]. Trends Microbiol, 2008, 16(10): 496-506.DOI:10.1016/j.tim.2008.07.004.

[6]Winstanley C, Fothergill JL. The role of quorum sensing in chronic cystic fibrosis Pseudomonas aeruginosa infections[J]. FEMS Microbiol Lett, 2009, 290(1): 1-9.DOI:10.1111/j.1574-6968.2008.01394.x.

[7]K?hler T, Buckling A, van Delden C. Cooperation and virulence of clinical Pseudomonas aeruginosa populations[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(15): 6339-6344.DOI:10.1073/pnas.0811741106.

[8]Hibbing ME, Fuqua C, Parsek MR, et al. Bacterial competition: surviving and thriving in the microbial jungle[J]. Nat Rev Microbiol, 2010, 8(1): 15-25.DOI:10.1038/nrmicro2259.

[9]Inglis RF, Gardner A, Cornelis P, et al. Spite and virulence in the bacterium Pseudomonas aeruginosa[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(14): 5703-5707.DOI:10.1073/pnas.0810850106.

[10] Lee S, Hinz A, Bauerle E, et al. Targeting a bacterial stress response to enhance antibiotic action[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2009, 106(34):14570-14575.DOI:10.1073/pnas.0903619106.

[11] Cornforth DM, Popat R, McNally L, et al. Combinatorial quorum sensing allows bacteria to resolve their social and physical environment[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2014, 111(11):4280-4284.DOI:10.1073/pnas.1319175111.

[12] Mathee K, Narasimhan G, Valdes C, et al. Dynamics of Pseudomonas aeruginosa genome evolution[J].Proc natl Acad Sci USA, 2008, 105(8): 3100-3105.DOI:10.1073/pnas.0711982105.

[13] Julou T, Mora T, Guillon L, et al. Cell-cell contacts confine public goods diffusion inside Pseudomonas aeruginosa clonal microcolonies[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(31): 12577-12582.DOI:10.1073/pnas.1301428110.

[14] O′Loughlin CT, Miller LC, Siryaporn A, et al. A quorum-sensing inhibitor blocks Pseudomonas aeruginosa virulence and biofilm formation[J].Proc Natl Acad Sci USA, 2013, 110(44): 17981-17986.DOI:10.1073/pnas.1316981110.

(本文編輯：林永麗)

(收稿日期：2015-08-17)

[中圖分類號]R378.991

[文獻標識碼]B[DOI]10.3969/j.issn.1009-0754.2016.02.029

[基金項目]國家自然科學基金項目(NO：81271796)；上海市自然科學基金項目(NO：09ZR1421000)

[作者單位]200433上海，海軍醫學研究所艦艇衛生研究室(陳雙紅、徐雄利)，高氣壓與潛水生理學全軍重點實驗室(陳銳勇、肖衛兵)