胃癌p16基因啟動子區甲基化狀態的研究

白艷麗++金建軍++劉獻民等

【摘要】 目的 檢測胃癌組織中p16基因啟動子區域甲基化狀態， 并分析其在胃癌發生、發展過程中的作用。方法 應用甲基化特異性PCR技術對42例胃癌組織（胃癌組）、42例癌前病變組織（癌前病變組）、60例正常對照胃黏膜組織（健康對照組）中p16基因啟動子區域甲基化狀態進行檢測， 結合臨床病理資料， 分析其在胃癌發生、進展中可能發揮的作用。結果 42例胃癌組織中p16基因啟動子區域甲基化陽性率為52.4%， 癌前病變組織中為11.9%， 正常組織中為1.7%， 組間比較差異有統計學意義（P<0.05）。低分化型胃癌組織中p16基因甲基化陽性率明顯高于高分化與中分化型胃癌組織， 有淋巴結轉移的胃癌組織中p16基因甲基化陽性率明顯高于無淋巴結轉移組。結論 p16基因甲基化在胃癌發生的促進和進展階段也發揮著重要作用， 對早期胃癌診斷具有潛在的臨床應用價值。

【關鍵詞】 胃癌；p16基因；甲基化

DNA甲基化是目前研究最為深入一種表觀遺傳學形式[1]。本研究采用甲基化特異性聚合酶鏈反應（MSP）研究胃癌及癌前病變中p16基因啟動子區甲基化狀況， 旨在了解胃癌中p16基因啟動子區域甲基化與胃癌臨床病理指標之間的關系， 以認識p16基因甲基化與胃癌發生、發展的關系。現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 選取本院2014年10月～2015年7月收治的42例胃癌組織標本作為胃癌組， 其中男27例， 女15例；高/中分化25例， 低分化17例；有淋巴結轉移者20例， 無淋巴結轉移者22例。所有患者均經病理確診， 且組織標本前未進行任何抗腫瘤治療。選取本院同期收治的42例癌前病變胃鏡活檢標本作為癌前病變組， 包括慢性萎縮性胃炎伴中-重度腸上皮化生18例， 慢性萎縮性胃炎伴中-重不典型增生14例， 中-重腸上皮化生合并中-重不典型增生10例。男27例， 女15例。另取60例胃鏡檢查的健康人或慢性淺表性胃炎患者作為健康對照組， 排除妊娠、外傷、慢性病毒性肝炎及風濕免疫性疾病。男28例， 女32例。

1. 2 標本采集及DNA提取 標本取下后， 置入做好標記的凍存管中， 立即投入液氮。保存于-80℃冰箱， 以備后用。樣本DNA提取：采用TIANamp Macro DNA Kit（天根）試劑盒， 嚴格按照說明書操作步驟進行。應用EZ DNA Methylation-Gold KitTM對所得血漿循環DNA樣本及人甲基化基因組DNA標準品（天恩澤）進行亞硫酸氫鹽修飾。

1. 3 甲基化特異性PCR p16基因甲基化（M）和非甲基化（U）序列的特異性引物由上海生工公司合成。瓊脂糖凝膠電泳判定PCR產物。

1. 4 統計學方法 采用SPSS19.0統計學軟件處理數據。計量資料以均數±標準差（ x-±s）表示， 采用t檢驗；計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異有統計學意義。

2 結果

2. 1 MSP產物判定 甲基化引物擴增出目的條帶（無論非甲基化引物能否擴增出目的條帶）作為陽性結果；非甲基化引物擴增出目的條帶且甲基化引物未擴增出目的條帶作為陰性結果。

2. 2 胃癌組與癌前病變組、健康對照組p16基因甲基化狀態比較 胃癌組42例標本中， 22例為甲基化， 陽性率為52.38%；癌前病變組42例標本中， 5例為甲基化， 陽性率為11.90%；對照組60例標本中， 1例為甲基化， 陽性率為1.67%， 組間差異具有統計學意義（χ2=42.91， P<0.001）， 由正常、癌前病變到胃癌的轉化過程中p16基因甲基化陽性率呈逐步增加的趨勢。

2. 3 胃癌組不同臨床病理特征與p16基因甲基化狀態的關系 不同年齡、性別組間的胃癌組織p16基因甲基化陽性率比較差異無統計學意義（P>0.05）；低分化型胃癌組織中p16基因甲基化陽性率82.4%（14/17）明顯高于高分化與中分化型胃癌組織32.0%（8/25）， 有淋巴結轉移的胃癌組織中p16基因甲基化陽性率80.0% （16/20）明顯高于無轉移組37.5%（6/16）。

3 討論

DNA甲基化是指在DNA雙螺旋中， DNA甲基轉移酶催化下， S-腺苷甲硫氨酸中的活性甲基轉移到特定堿基的過程， 其在腫瘤的發生發展過程中起到重要的作用。p16基因的功能產物， p16基因的失活存在于大多數腫瘤中， 失活機制包括基因的缺失和啟動子區域高甲基化[2]。本研究發現， 在由正常、癌前病變到胃癌的轉化過程中p16基因甲基化陽性率呈逐步增加的趨勢， 提示p16基因啟動子區域CpG島甲基化可能是發生于胃癌早期的分子事件之一。低分化組、區域淋巴結轉移陽性組p16基因甲基化率顯著高于高/中分化組、區域淋巴結轉移陰性組， 提示p16基因甲基化在胃癌發生的促進和進展階段也發揮著重要作用。

腫瘤相關基因的甲基化狀態異常可能在腫瘤發生的啟動、促進和進展階段均發揮著重要作用。這種CpG島高甲基化異常在腫瘤預防和治療中均有重要的應用價值[3]。DNA甲基化在腫瘤診斷、化療敏感性和預后評價等方面的應用價值已得到重視。發生DNA甲基化的腫瘤比DNA序列突變腫瘤， 遺傳性損傷容易糾正， 經去甲基化治療特異性地糾正過來， 繼而恢復其表達狀態， 已被認為是極有發展前景的腫瘤治療的新手段[4-6]。

參考文獻

[1]劉文天， 焦煥利， 楊玉龍， 等. p16基因高甲基化在胃癌發展中的作用.世界華人消化雜志， 2007， 15（26）：2839-2843.

[2]Morris MR， Ricketts CD， Abdulrahman M， et al. Identification of candidate tumour suppressor genes frequently methylated in renal cell carcinoma. Oncogene， 2010， 29（14）：2104-2117.

[3]Peng D， Zhang H， Sun G. The relationship between P16 gene promoter methylation and gastric cancer： a meta-analysis based on Chinese patients. J Cancer Res Ther， 2014， 10 Suppl（8）：292-295.

[4]Zhang P， Pollock RE. Epigenetic Regulators： New Therapeutic Targets for Soft Tissue Sarcoma. Cancer Cell Microenviron， 2015， 1（4）：e191.

[5]Kang N， Shah VH， Urrutia R. Membrane-to-Nucleus Signals and Epigenetic Mechanisms for Myofibroblastic Activation and Desmoplastic Stroma： Potential Therapeutic Targets for Liver Metastasis？ Mol Cancer Res， 2015， 13（4）：604-612.

[6]Cabezas-Cruz A， Lancelot J， Caby S， et al. Epigenetic control of gene function in schistosomes： A source of therapeutic targets？ Front Genet， 2014（5）：317.

[收稿日期：2016-01-22]