?；撬釋乐馗骨桓腥敬笫竽c黏膜屏障功能的影響

蔡景融　武華　程鞏

[摘要] 目的 通過建立大鼠嚴重腹腔感染模型，檢測血漿二胺氧化酶（diamine oxidase，DAO）的活性及D-乳酸含量，探討?；撬釋乐馗骨桓腥敬笫竽c黏膜屏障的保護作用。 方法 實驗于2015年5～7月將54只雄性SD大鼠隨機分為三組：對照組（C組）、腹腔感染組（I組）和治療組（T組），每組18只。C組僅輕微翻動盲腸后關腹，I、T兩組采用盲腸結扎穿孔法（cecal ligation plus puncture，CLP）。T組于術后即刻腹腔注射?；撬崛芤海?00 mg/kg），而C組、I組術后即刻腹腔注射等體積生理鹽水。各組分別于造模后6、12、24 h隨機取6只大鼠，檢測血漿DAO活性和D-乳酸含量。 結果 C組各檢測指標在各時間點無明顯差異，差異無統計學意義（P>0.05），I組、T組各檢測指標均隨時間延長呈增高趨勢。I組、T組各檢測指標在各時間點均高于C組，差異均有統計學意義（P<0.05），T組各檢測指標在各時間點均低于I組，差異均有統計學意義（P<0.05）。 結論 牛磺酸對大鼠嚴重腹腔感染時腸黏膜屏障功能有一定的保護作用。

[關鍵詞] 牛磺酸；腹腔感染；腸黏膜屏障；二胺氧化酶；D-乳酸

[中圖分類號] R605 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）07-0022-03

[Abstract] Objective To explore the possible protective effect of taurine on intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection through established the model of rats with severe abdominal infection， measuring the activity of diamine oxidase（DAO） and the concentration of D-lactic acid in plasma. Methods From May to July 2015 fifty-four SD males rats were randomly divided into three groups， 18 rats in each group）： control group （group C）， abdominal infection group（group I） and treatment group（group T）. The rats of group C were only slightly changed the cecal several times before definitive abdominal closure. The rats in group I and group T were established by cecal ligation and puncture （CLP）. The rats in group T received intraperitoneal injection of taurine（200 mg/kg） immediately after the operation， however， the rats in group C and group I received intraperitoneal injection of equivoluminal normal saline. Six rats in each group were randomly picked up at 6， 12， 24 h after operation to have the activity of diamine oxidase （DAO） and the concentration of D-lactic acid in plasma measured. Results There was no significant difference at each time point of each detection index in group C（P>0.05）. In group I and group T， each detection index was rising with increased postoperative time， and they were higher than those of group C at each time point， there was significant difference（P<0.05）. Compared with group I， each detection index of group T was lower at each time point， there was significant difference（P<0.05）. Conclusion Taurine has a certain protective effect on intestinal mucosal barrier function in rats with severe abdominal infection.

[Key words] Taurine； Abdominal infection； Intestinal mucosal barrier； Diamine oxidase； D-lactic acid

腹腔感染在普通外科較為常見，多由手術、創傷、消化道穿孔、急性胰腺炎、腸外瘺等原因導致。嚴重腹腔感染時，腸黏膜在各種致病因素作用下出現不同程度的損傷，通透性有所增加，腸道內的細菌（多為革蘭陰性桿菌）和內毒素從腸腔經門靜脈、淋巴循環移位可進一步引發全身炎癥反應綜合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS）、膿毒癥、甚至多器官功能障礙綜合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）[1]，病情嚴重，治療費用昂貴。?；撬崾且环N由含硫氨基酸轉化而來的β-氨基酸，由于其分子結構中的羧酸基被磺酸基取代，所以?；撬岵⒉粎⑴c蛋白質的合成。急性炎癥反應時，由于中性粒細胞嗜天青顆粒內髓過氧化物酶（myeloperoxidase，MPO）的催化作用，細胞內氧化應激產生的H2O2與Cl-、Br-反應生成次氯酸、次溴酸，而?；撬崤c兩者相互作用，減輕了次氯酸、次溴酸對正常組織的氧化損傷，并生成具有殺菌、抗炎、抑制氧化應激的作用的?；撬崧劝?、牛磺酸溴胺[2]。本實驗通過多時間點比較各組大鼠血漿DAO活性、D-乳酸含量變化，探討牛磺酸對大鼠腹腔感染早期腸黏膜屏障功能的保護作用，為將來臨床應用提供一定依據。

1 材料與方法

1.1 動物來源

同系、出生日期相近、健康的雄性SD大鼠54只（重量200～230 g），購自山西醫科大學動物實驗中心，許可證號：SCXK（晉）2015-0001。造模前于山西醫科大學生理實驗室適應性飼養7 d，稱重、編號。

1.2 主要試劑和儀器

牛磺酸（5 g）購于美國Sigma公司（北京索萊寶公司分裝）、二胺氧化酶（DAO）及D-乳酸試劑盒均購于美國Sigma公司（由武漢博士德生物工程公司分裝）。上海奔普電子天平（型號為BSM-180.4），德國Eppendorf臺式低溫離心機（型號為minispin），上海博訊電熱恒溫水浴鍋（型號為HHSII-1），日本紫外分光光度計（型號UA-16A）。

1.3 ?；撬崛芤旱呐渲品椒?/p>

應用電子天平稱取?；撬? g，用量筒量取100 mL生理鹽水，將稱取的牛磺酸溶解于其中，配制成2%的?；撬崛芤阂詡湓炷：笫褂?，1周內有效。

1.4 實驗分組和模型建立

實驗于2015年5～7月將54只大鼠按隨機數字表法分為三組，即對照組（C組）、腹腔感染組（I組）和治療組（T組），每組18只。術前12 h禁食、不禁水。采用盲腸結扎穿孔法（cecal ligation plus puncture，CLP）制作嚴重腹腔感染模型[3]。步驟如下：①稱重后腹腔注射10%水合氯醛（100 mg/kg）麻醉；②用醫用橡皮膠帶固定大鼠四肢后電推剃毛備皮、碘伏消毒；③于中、下腹做長度約2 cm的正中切口，沿中線逐層進入腹腔；④輕微翻動腸管、系膜，識別盲腸并將其暴露于腹腔外；⑤用絲線結扎盲腸盲端約1.5 cm，注意確?；亟Y腸通暢；⑥使用18G注射器針頭在盲端穿刺兩對孔，擠出部分糞便；⑦還納盲腸后分兩層關腹，皮下注射預熱37℃生理鹽水（50 mL/kg）補液并防止休克，清醒后自由飲食。C組大鼠經開腹后輕微翻動盲腸后關腹，不行第⑤、⑥兩步操作；I、T兩組大鼠均行盲腸結扎穿孔術。T組大鼠術后腹腔注射牛磺酸溶液（200 mg/kg），C、I兩組大鼠術后腹腔注射等體積生理鹽水。術后分籠飼養，清醒后自由飲食。

1.5 DAO、D-乳酸檢測

于造模后6、12、24 h三個時間點，每組隨機選取6只大鼠，仍采用水合氯醛（100 mg/kg）腹腔注射麻醉，用一次性采血針取腹主動脈血約5 mL于真空采血管中，離心15 min（3000 r/min），取血漿上清液2 mL于EP管中，置于-20℃冰箱中儲存待測。采血后應用頸椎脫臼法將大鼠處死。采用分光光度法，嚴格依照試劑盒說明書，逐步檢測血漿DAO活性和D-乳酸含量。

1.6 統計學分析

應用統計學軟件SPSS17.0對實驗所得數據進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示，多組間比較采用單因素方差分析（one-way ANOVA），P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 大體觀察和腹腔情況

對照組（C組）：大鼠清醒后，可見其活動能力均較正常時稍有減弱，體溫、心率以及呼吸頻率正常，造模12 h后可見覓食行為；各時間點打開腹腔，均可見腸管能夠正常蠕動，未見腸管擴張、粘連及明顯腹水。腹腔感染組（I組）：大鼠清醒后逐漸出現體溫升高、寒戰，精神萎靡，反應遲鈍，活動能力明顯減弱，心率、呼吸頻率明顯增快，可見腹瀉癥狀。腹腔可見腸管明顯擴張、積氣，回盲部粘連，腹腔有積液、積膿。盲腸表面可見膿性分泌物，盲腸盲端變黑、壞死。腹腔所見情況隨造模后時間延長而加重。治療組（T組）：大鼠清醒后逐漸出現體溫升高、活動能力減弱，心率及呼吸頻率加快，但程度均低于I組。腹腔可見腸管不同程度擴張、積氣、回盲部粘連，腸管尚有蠕動，腹腔有積液，少量積膿，均較I組少。盲腸盲端變黑、壞死。

2.2血漿DAO活性的測定

C組各時間點DAO活性比較，差異無統計學意義（P>0.05），I、T兩組DAO活性隨著時間推移呈增高走勢，且在相應的時間點均高于C組，差異均有統計學意義（P<0.05），T組DAO活性在各時間點均低于I組，差異均有統計學意義（P<0.05）。

2.3 血漿D-乳酸含量的測定

C組各時間點D-乳酸含量比較，差異無統計學差異（P>0.05），I、T兩組D-乳酸含量隨著時間推移呈增高走勢，且在相應的時間點均高于C組，差異均有統計學意義（P<0.05），T組D-乳酸含量在各時間點均低于I組，差異均有統計學意義（P<0.05）。見表2。

3 討論

腸黏膜屏障是指機體能夠防止腸腔內的細菌和毒素通過腸黏膜淋巴、血液循環而進入體內其他組織或器官的結構和功能的總和[4]。研究表明，嚴重腹腔感染時，腸黏膜出現不同程度的病理變化，如腸黏膜出現水腫、炎性細胞浸潤、上皮細胞壞死脫落等，這一系列變化導致致病菌及內毒素移位，進而引起腸源性感染、內毒素血癥，極有可能進展為全身炎癥反應綜合征[5]。因此腸黏膜損傷、通透性增加既是嚴重腹腔感染導致的結果，又是病情急劇惡化的主要原因之一。

嚴重腹腔感染時，腸黏膜會出現缺血再灌注損傷和炎癥反應。從嚴重腹腔感染到SIRS、MODS的發生、發展過程中常伴有不同程度血流動力學改變，腸道血流量減少，而腸黏膜固有的絨毛微血管結構，使其對缺血、缺氧特別敏感，腸黏膜因缺血缺氧出現一定程度的損傷，然而恢復血液灌流后腸黏膜損傷進一步加重，即腸道缺血再灌注損傷。有研究表明，?；撬崧劝凡粌H可以氧化含有巰基的氨基酸、蛋白質，還能以N-Cl共價鍵的形式與細菌表面蛋白結合，進而降低細菌毒力、抑制細菌繁殖[6]；?；撬崧劝贰⑴；撬徜灏纺軌蛞种仆淌杉毎钚?，降低其消耗氧氣并誘發呼吸爆發的能力，除此之外，?；撬崧劝房杉せ罴毎|中轉錄因子NF-E2相關因子2（Nrf2）與細胞核內的抗氧化反應元件（ARE）結合，進一步增強一些抗氧化酶的表達，如血紅素加氧酶、過氧化物氧化還原酶、硫氧還原蛋白等[7]；牛磺酸氯胺通過抑制核因子κB抑制蛋白激酶（IKK）的活性，減輕核因子κB抑制蛋白-α（IκB-α）的降解，防止因核因子κB（NF-κB）的激活所導致調控促炎因子（iNOS、TNF-α等）的基因序列轉錄增強[8]，這種抑制促炎因子形成作用呈劑量依賴性[9]。

腸黏膜屏障損傷時，腸道固有細菌大量增殖，代謝發酵產生的D-乳酸可通過受損腸黏膜入血，由于哺乳動物體內缺乏D-乳酸脫氫酶而代謝緩慢，故檢測血漿D-乳酸含量變化能準確反映腸黏膜通透性變化[10]。95%以上的DAO儲存于是小腸絨毛上皮細胞內，生理條件下血漿中含量甚微，其活性與腸黏膜上皮蛋白質、核酸代謝有關。腸黏膜屏障損傷后釋放入血，當外周血增加的速度超過肝臟的清除速度時可被檢測到，故檢測血漿DAO活性可間接反映腸黏膜機械屏障的完整性[11]。目前，在實驗研究中血漿DAO檢測通常作為腸黏膜損傷的一個重要輔助標志物，其特異性為100%，準確性為95%，敏感性為94%[12-15]。

本研究結果顯示，I、T兩組大鼠大體觀察及腹腔情況明顯復雜于C組，體溫、心率、呼吸頻率均不同程度升高，腹腔均可見腹水、腸管粘連、盲腸盲端壞死等，但是T組整體程度較I組有所減輕。C組大鼠DAO活性及D-乳酸含量在各時間點比較并無明顯差異，I、T兩組大鼠DAO活性及D-乳酸含量隨時間延長呈增高趨勢，造模6 h后即出現輕微的腸黏膜損傷，通透性增加。隨著時間的延長，造模24 h后I、T兩組大鼠DAO活性及D-乳酸含量最高，說明此時I、T兩組大鼠腸黏膜損傷最重，但是相較于I組，T組大鼠DAO活性及D-乳酸含量在相應時間點均低于I組，差異均有統計學意義（P<0.05），表明?；撬釋Υ笫髧乐馗骨桓腥緯r腸黏膜損傷有較好的保護、修復作用，具體機制和量效關系還待進一步研究，可為臨床應用于腸內營養等提供一定依據。

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（收稿日期：2015-11-21）