中樞神經系統白血病患者腦脊液循環DNA含量檢測及臨床意義

武金日　閆軼鵬　吳隼

[摘要] 目的 定量檢測中樞神經系統白血病患者腦脊液循環DNA的含量并探討其臨床意義。 方法 收集2014年8月～2015年7月間的急性白血病、中樞神經系統白血病治療前、后患者各20例；留取同期非惡性血液腫瘤患者20例為對照組，微量DNA提取試劑盒提取腦脊液循環DNA，SYBR green熒光染色法測定腦脊液循環DNA濃度。結果 1.腦脊液循環DNA電泳條帶在100～1000 bp之間。2.中樞神經系統白血病組循環DNA濃度為[（330.97±35.49）ng/mL]、急性白血病組循環DNA濃度為[（79.18 ±2.22）ng/mL]，均明顯高于非惡性血液病組腦脊液循環 DNA 濃度[（7.83 ±1.85）ng/mL]（P=0.000；P=0.000）；中樞神經系統白血病患者治療緩解后腦脊液循環DNA濃度[（141.77±37.56）ng/mL]明顯低于治療前組循環DNA濃度[（330.97±35.49）ng/mL]（P=0.000）。 結論 腦脊液循環DNA水平與中樞神經系統白血病細胞浸潤具有明顯相關性，在中樞神經系統白血病早期診斷及病情監測方面有一定的臨床價值。

[關鍵詞] 循環DNA；中樞神經系統白血病；腦脊液；腫瘤標志物

[中圖分類號] R733.7 [文獻標識碼] A [文章編號] 1673-9701（2016）07-0019-03

[Abstract] Objective To quantify the circulating DNA in cerebrospinal fluid（CSF） from patients with CNSL and evaluate its potential clinical value. Methods Cerebrospinal fluid samples were collected from 20 patients with CNSL before Intrathecal chemotherapy， 20 patients with CNSL after Intrathecal chemotherapy，20 acute leukemia patients and 20 patients without hematological malignancy from August 2014 to July 2015. The cerebrospinal fluid DNA was extracted by commercial kit and detected by fluorescntmeter. Results 1.Circulating DNA electrophoresis bands were between 100～1000 bp. 2.Statistical significance（P=0.000； P=0.000） in mean circulating cerebrospinal fluid DNA levels were found between patients without hematological malignancy[（7.83±1.85）ng/mL] and patients with acute leukemia [（79.18±2.22）ng/mL]，with CNSL patients were[（330.97±35.49）ng/mL]. Circulating DNA levels of acute leukemia without CNSL after chemotherapy[（141.77±37.56）ng/mL] were less than without chemotherapy [（330.97±35.49）ng/mL]（P=0.000）. Conclusion The Circulating DNA levels significant correlated with central nervous system leukemia，it can initially predict the metastasis potential and prognosis of those CNSL patients.

[Key words] Circulating DNA； Central Nervous System Leukemia； Cerebrospinal fluid； Tumor marker

中樞神經系統白血病系白血病細胞浸潤蛛網膜或蛛網膜鄰近組織所致，是白血病復發的主要根源。中樞神經系統白血病早期無明顯臨床癥狀，主要依靠發病后腦脊液沉渣鏡檢診斷。該方法早期診斷率低。針對中樞神經系統白血病的少創傷、簡便可靠以獲得早期診斷成為研究目標。近年來循環DNA做為一種新型的腫瘤標志物在腫瘤疾病方面的研究[1，2]成為了熱點。健康人的循環DNA主要來源于細胞凋亡，而惡性腫瘤患者的循環DNA主要由腫瘤細胞分泌及壞死、凋亡、微轉移灶所釋放[3]。故檢測循環DNA含量用于惡性腫瘤早期診斷與治療效果判斷成為可能。定量檢測中樞神經系統白血病患者腦脊液循環DNA的含量，旨在探討腦脊液循環DNA含量在中樞神經系統白血病臨床應用方面的價值。

1 資料與方法

1.1 一般資料

選取2014年8月～2015年7月間急性白血病患者20例（男11例，女9例，平均年齡36.0歲），中樞神經系統白血病治療前患者20例（男12例，女8例，平均年齡37.6歲）及治療后患者（男11例，女9例，平均年齡37.3歲）20例；同期非惡性血液腫瘤患者20例（男11例，女9例，平均年齡38.2歲）為對照組。各組一般資料具有可比性。急性白血病診斷分型參照世界衛生組織（WHO）2008年公布的造血與淋巴系統腫瘤的診斷分型標準。中樞神經系統白血病診斷標準：①頭部MR/CT（平掃+增強）浸潤或塊狀病變；②能除外其他原因的顱神經癱瘓及視網膜浸潤，及CSF、MR/CT未見異常，③CSF中有幼稚細胞，且WBC>5×10-9/L，除外腰穿損傷。診斷成立須符合以上至少一項。三聯鞘注防治中樞神經系統白血病（藥物劑量：地塞米松10 mg+阿糖胞苷50 mg+甲氨蝶呤15 mg）。入組病例均應排除其他惡性腫瘤，無類風濕關節炎等免疫性疾病，無外傷、肝腎等臟器損傷性疾病。

1.2 標本采集

急性白血病患者緩解后腰穿留取腦脊液1.5 mL，中樞神經系統白血病患者分別于確診時與治療緩解后腰穿留取腦脊液1.5 mL，非惡性血液腫瘤患者腦脊液常規檢查留取1.5 mL。4℃、3000 r/min離心10 min，EP管收集上清液-80℃低溫保存。

1.3 循環DNA提取

按照QIAamp DNA Blood Mini Kit試劑盒（德同Qiagen公司）說明書所述方法提取循環DNA。紫外分光光度計NanoDrop 2000（Thermo Fisher Scientific公司，美國）初步檢測提取純度及效率，瓊脂糖凝膠電泳分析循環DNA的完整性。

1.4 DNA定量

取1 μL純化的腦脊液DNA，與等體積Picogreen熒光染料均勻混合，應用Qubit2.0熒光儀測定熒光值，計算DNA含量。

1.5 統計學處理

應用SPSS18.0統計學軟件進行分析，計量資料以均數±標準差（x±s）表示。兩組間比較采用獨立樣本t檢驗，多個組樣本均數之間比較用方差分析，P<0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 腦脊液中循環DNA的瓊脂糖凝膠電泳結果

循環DNA瓊脂糖凝膠片電泳，染色后紫外燈下直接觀察循環DNA片段大小分布。其中CNSL組、CNSL治療后組可見清晰條帶。對照DNA mark電泳結果，循環DNA電泳條帶在100～1000 bp之間。見圖1。

2.2 對照組、急性白血病組患者腦脊液DNA含量

中樞神經系統白血病組循環DNA濃度為[（330.97±35.49）ng/mL]、急性白血病組循環DNA濃度為[（79.18±2.22）ng/mL]，均明顯高于非惡性血液病組腦脊液循環 DNA 濃度[（7.83±1.85）ng/mL]差異有統計學意義（P=0.000）；中樞神經系統白血病患者治療緩解后腦脊液循環DNA濃度[（141.77±37.56）ng/mL]明顯低于治療前組循環DNA濃度[（330.97±35.49）ng/mL]，差異有統計學意義（P=0.000）。中樞神經系統白血病患者治療緩解后腦脊液循環DNA濃度[（141.77±37.56）ng/mL]仍明顯高于急性白血病組循環DNA濃度[（79.18±2.22）ng/mL]，差異有統計學意義（P=0.000）。

3 討論

循環DNA在1948年被發現，隨后發現腫瘤患者的循環DNA與其腫瘤組織表現出共同的遺傳學性狀[4-8]。對循環DNA的來源研究表明腫瘤患者的循環 DNA 主要來源為腫瘤細胞主動分泌、壞死及凋亡、微轉移灶等釋放[3]。中樞神經系統白血病惡性增殖的白血病細胞及化療藥物導致的細胞壞死和凋亡，都可改變者腦脊液中的循環 DNA，因此腦脊液循環DNA的檢測為我們早期診斷及治療效果監測提供新的思路。

本研究循環DNA電泳分子量介于100 bp～1000 bp之間，與Stroun M[9]的研究結果相似。原因可能循環DNA的來源有關。健康人循環DNA主要來源于細胞凋亡，該來源的循環DNA片段較短，一般小于200 bp。腫瘤患者循環DNA則主要由腫瘤細胞壞死產生，其電泳出更長的循環DNA片段[3]。多種腫瘤患者循環DNA水平高于健康人，并表現出與腫瘤細胞相同的生物學特性[5-7]。目前為止，循環DNA來源機制仍不十分清楚。

我們采用Picogreen 熒光染色法[8]對循環 DNA 定量檢測。結果顯示患者中樞浸潤后腦脊液循環DNA水平明顯升高。既往研究表明多種實體腫瘤患者循環DNA 水平高于健康人[5-7，9]。關于白血病患者的研究也顯示循環DNA水平升高[10，11]。Leon等[12]的研究顯示腫瘤負荷高的患者循環DNA水平更高。惡性血液病循環 DNA 水平高于實體腫瘤，可能與體液中腫瘤細胞多有關，提示循環腫瘤細胞與循環 DNA 有一定的相關性，而循環腫瘤細胞與腫瘤轉移相關[13，14]。國內惡性血液病循環 DNA研究較少，孫開勝[15]等采用 SYBR green 熒光染色法對急性白血病患者血循環 DNA 定量分析，發現發病后循環DNA升高。本研究比較急性白血病患者中樞浸潤前后腦脊液循環 DNA 水平，發現兩者之間有顯著差異，結合急性白血病特點分析，導致本結果的可能有以下原因：急性白血病細胞定植中樞大量增殖導致循環DNA釋放；血腦屏障阻止以蛋白結合形式的循環DNA進入外周血，避免被肝臟迅速代謝[8]。

化療后腫瘤負荷降低，腫瘤細胞來源的循環 DNA隨之減少，循環 DNA 水平下降[16]。我們比較中樞神經系統白血病患者化療前、后腦脊液循環DNA 水平，發現治療后較治療前明顯減少，治療效果好的患者更明顯，顯示出其與病情變化明顯相關。中樞神經系統白血病患者治療后腦脊液循環DNA水平仍高于未合并中樞浸潤患者，考慮化療并不能完全清除腫瘤細胞，殘留的白血病細胞仍能增加循環DNA的水平，這也可能與中樞神經系統白血病即使治療后仍多見復發有關。

綜上所述，定量檢測中樞神經系統白血病患者診治過程中循環DNA水平變化，中樞神經系統白血病發病后腦脊液循環DNA水平顯著升高，治療后明顯下降。顯示出對疾病的早期診斷及病情監測有一定的指導意義。通過對中樞神經系統白血病患者腦脊液循環DNA的檢測，我們可以更早診斷及預測病情變化，具有較大的可行性。對循環DNA的研究，有可能為中樞神經系統白血病的早期診斷、病情監測提供特異性好、靈敏度高的新的預測指標。

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（收稿日期：2015-11-24）