BIOLOG在土壤微生物群落功能多樣性研究中的應用

湯朋先　荊英　徐志英

摘 要 一直以來，微生物的研究人員都無法解決關于微生物群落實驗中的一些技術問題。BIOLOG技術的出現，為研究人員提供了新的研究思路。為了更好地描述土壤的微生物群落所具有的多樣性功能，生物學家致力于對該實驗的研究。BIOLOG技術是一種比較簡單且快捷的研究方法，能夠為研究人員提供比較基礎的培養方法，使微生物在實驗中反映出微生物群落的代謝多樣性。筆者從BIOLOG技術釋義角度出發，深入研究了實驗研究的相關原理，找出了實驗中將會存在的問題，并給出了合理的解決措施，期望能夠為土壤的微生物群落實驗提供借鑒。

關鍵詞 BIOLOG技術；土壤；微生物群落；功能多樣性；應用分析

中圖分類號：S714.6 文獻標志碼：B DOI：10.19415/j.cnki.1673-890x.2016.21.144

近年來，生物學家在土壤方面的微生物群落的相關研究中采用BIOLOG技術，該種技術有助于提高生物反應的靈敏度，并促使研究人員能夠更加清楚地分辨這些變化。而在BIOLOG技術下的微生物研究不需要采用分離的方式來培養純種的微生物，能夠保留住微生物的群落原有的特性。研究人員在BIOLOG技術的支持下清晰地記錄下生物反應的相關數據，并在計算機中存儲研究數據及研究結果。該種技術能夠在很大程度上提高研究人員的研究效率，并使微生物研究的成功率提高。

1 BIOLOG技術釋義

BIOLOG技術是由美國一家叫做BIOLOG的公司在1989年開始研發的，當時該公司將95種唯一碳源放在一起，進行了生物化學反應的相關測試。而該技術就是在該種研究中被應用[1]。BIOLOG技術最早用于對純種的微生物鑒定。后來研究人員已經能夠體會BIOLOG技術在生物研究中所帶來的益處，將該技術運用到更多的領域當中。如今，BIOLOG技術已經能夠用于鑒定細菌、霉菌等多種病原微生物。Garland和Mill兩位生物研究人員在1991年將BIOLOG技術的應用領域再一次拓展，在土壤的微生物研究中采用了該種技術，并研究了微生物的群落是怎樣的生物反應。

2 BIOLOG技術在土壤的微生物群落的功能研究原理

BIOLOG技術的研究載體是一個擁有多達96個孔洞的微孔板。在研究的過程中，研究人員通常會將其中的95個孔都加入不同的單一碳源并在其中添加四唑染料。那么，在微孔板中還剩余一個孔，研究人員利用剩余的一個孔進行對照試驗，在保障該孔洞不被加入碳源的同時，加入適量的水，以此來觀察該對照孔洞與其他孔洞的不同[2]。在微生物與該微孔板連接時，微生物將會與孔洞中的原料發生不同的反應。其中添加了碳源的孔洞將會產生氧化還原現象，而孔洞中的四唑染料也將在微生物的作用下變成紫色。此實驗能夠為研究人員提供一定的數據，表示該微生物能夠利用該種碳源。BIOLOG技術已經建立了包括1 449種細菌信息的數據庫，該數據庫能夠為利用BIOLOG技術的研究人員提供關于鑒定微生物是否被分離純化的結果信息。而當Garland和Mill兩位研究人員將該技術運用到土壤的微生物研究中時，BIOLOG技術將以相似的原理來顯示關于土壤微生物的群落多功能性的鑒定結果，并幫助研究人員分析土壤的微生物群落是否存在代謝多樣化的現象。

3 BIOLOG技術在土壤的微生物群落的多樣性功能研究中存在的問題

基于BIOLOG技術的突然微生物的功能多樣性研究盡管在很早以前就已經有研究人員研究實驗，但時至今日，該研究還是會存在著一定的問題。

在對土壤的微生物群落研究當中，研究人員需要根據不同產生地點或者在同一地點，但在不同時間產生的微生物的物種來進行不同BIOLOG技術下微孔板的相關實驗[3]。在實驗當中，微孔板中不同的培養基其微生物的細胞活躍度也將產生不同的反應。而研究人員不僅需要清晰且有規律地記錄下每種反應結果的相關數據，還要觀察微孔板中不同孔洞的四唑染料顏色變化，如此才能正確判斷出土壤的微生物群落的功能。當然，在土壤的微生物群落實驗當中并不能很容易地判斷實驗結果，多種微生物在不同的微孔板中其顏色反應及其他的生物細胞反應都不一樣，也不是研究人員通過將數據簡單的相加就能夠計算出不同的生物群落所具有的功能性。這些反應的密度十分大，研究人員需要時刻的觀察該類反應的變化，而細胞本身是非常微小的事物，其變化的時間不確定，不同的培養基內的微生物變化現象也不同。因此，研究人員在BIOLOG技術下的土壤微生物研究會產生諸多問題。

一些研究人員會因為來不及觀察培養基中微生物的細微變化，而使實驗數據記錄出現錯誤，有些研究可能會由于研究過程中的相關物質添加不準確而造成實驗失去意義[4]。實驗過程中還可能引發的問題是研究人員來不及確定培養基的時間度讀數，因此而錯過了微孔板中一些孔洞的顏色變化。在土壤的微生物研究當中，BIOLOG技術下對于微孔板的接種密度將影響到整個研究的結果。而一旦對于微孔板中的孔洞接種密度存在了差異，就會使微生物與碳源之間的反映出現不同的表現結果。

4 BIOLOG技術在土壤的微生物群落的多樣性功能研究中問題的解決方法

要想解決BIOLOG技術在土壤的微生物群落的多樣性功能研究中的問題，研究人員首先要把握住整個BIOLOG技術的操作要點。從土壤的樣品采集以及其接種實驗的方面考慮，需要考慮到群落的相關變異[5]。設置多種驗證群落變異的相關實驗，盡量采用多次處理的方式來進行取樣。將取得的樣品放置到一起，以免因為樣品的防止地點不同，而使樣品存在差異。而在取出單個樣品時，研究人員需要采用滅菌的形式加入磷酸的緩沖液。依次將樣品放入到接種的板中。研究人員需要對樣品接種過程中的讀數進行糾正，以避免初始時間的讀數錯誤。從微孔板的培養步驟考慮，在BIOLOG技術下，將細菌版防止在固定的溫度當中，避免因為溫度變化而帶來的細菌變異。微孔板的固定培養溫度需要是在15～28。C[6]。關于微孔板讀數的相關操作，需要掌握讀數的波長以及數據的光密度，確保在590 nm的波長下對微孔板進行監測，并掌握平均的孔顏色。由于土壤微生物的群落研究需要進行多種研究，所以研究人員需要注意數據的分析和激勵。在眾多的數據當中，研究人員需要掌握更為科學的數據分析方法，從而進行主成分的分析及聚類的分析。

在進行土壤的微生物群落實驗時，除了要對以上問題進行注意并糾正以外，還需要在微孔板的培養過程中注意96個孔的原始差異，并對不同孔的數據進行細致的激勵，確保研究人員能夠觀察出在單一碳源的影響下，不同的樣品的功能差異。而在實驗當中接種密度已經為研究人員的實驗帶來的難題，但只要研究人員注意孔洞的實驗數據變化，就能夠緩解由于密度過大而帶來的顏色擴展影響，從而使研究人員更容易分辨出微孔板中不同孔中的樣品反映。在讀數的過程中，研究人員也要固定水平的AWCD，如此讀出的數值能夠與微孔板的數值進行對比，從而使研究人員能夠對微孔板內的數值進行重復讀數。只要研究人員根據多次讀數的數值篩選出接近水平AWCD所讀出的數值，就能夠作為實驗的參考數值來參與數據的分析[7]。此種方法能夠有效的減少實驗結果的差異，并使研究人員更輕易的完成讀數的工作。當然，要想排除接種過程中所產生的差異問題，研究人員也可以在接種之前將濃度調節到接近一致的數值，以此來減小接種過程中所存在的差異。但該種方式并不適用于所有的土壤微生物群落實驗。

利用上述方法，研究人員能夠更加了解實驗的對象及實驗的密度，并可以抑制微生物的差異性產生。研究人員嚴謹的操作實驗步驟，避免盲目轉換實驗數值，使接種密度以及光密度都保持在一定的數值內，完成了對土壤微生物群落的實驗，排除了實驗中存在的關鍵性技術問題，使實驗結果更加真實。

5 結論

盡管基于BIOLOG技術的土壤微生物的群落實驗還有一些遺留問題需要研究，但其功能的多樣性已經能夠在BIOLOG技術的支持下被研究人員實驗出來。相信只要研究人員克服了在研究中的技術問題，并保持對實驗的嚴謹態度，就能夠得出最真實的實驗結果。而BIOLOG技術也將不再局限于土壤的微生物群落實驗當中，而是向著更為廣闊的領域發展，從而體現BIOLOG技術的真正價值。

參考文獻

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[6]吳則焰，林文雄，陳志芳，等.武夷山國家自然保護區不同植被類型土壤微生物群落特征[J].應用生態學報，2013，24（8）：2301-2309.

[7]田雅楠，王紅旗.Biolog法在環境微生物功能多樣性研究中的應用[J].環境科學與技術，2011，34（3）：50-57.

（責任編輯：劉昀）