實時熒光定量RT—PCR內參基因的選擇

白金萍 劉芳 李麗

【摘 要】 實時熒光定量RT-PCR是在PCR反應體系中加入熒光化學基團，并通過實時熒光定量PCR儀，進行實時、自動檢測整個PCR擴增過程中的熒光信號，從而對擴增產物進行實時定量分析的方法。它具有高靈敏、高通量、定量準確、可重復、污染少等優點，被廣泛應用于基因診斷，病毒篩選，細胞和組織中RNA的定量等。在采用RT-PCR進行研究的過程中，我們通常需要加入內參基因作為參考，內參基因又稱為管家基因，它主要是用來平衡樣本之間濃度和純度的差異，減少實驗誤差，使得實驗結果更加準確，所以內參基因的選擇尤為重要。

【關鍵詞】 實時 熒光定量RT-PCR 內參基因

1 理想內參基因的選擇

理想的內參基因應該滿足以下條件：①不存在假基因（pseudogene）， 以避免基因組 DNA的擴增；②高度或中度表達， 排除太高或低表達；③穩定表達于不同類型的細胞和組織（如正常細胞和癌細胞）， 而且其表達量是近似的，無顯著性差別；④表達水平與細胞周期以及細胞是否活化無關；⑤其穩定的表達水平與目標基因相似；⑥不受任何內源性或外源性因素的影響， 如不受任何實驗處理措施的影響。排除內參基因的條件則為：①在正常和異常的細胞/組織中的表達存在差異；②呈現細胞周期依賴的表達；③定位于 X染色體[1]。

2 內參基因選擇存在的誤區

我們做RT-PCR實驗時通常存在兩個誤區，①選擇常用的內參基因，沒有經過實驗進行篩選，如β-actin、18SrRNA、B2M等是我們常選擇的內參基因，但有研究表明β-actin 當細胞向惡性轉化時，表達量會增加；B2M在軟骨細胞、吞噬細胞中均能夠穩定表達，但在骨髓間充質干細胞中表達較差[2，3]。②只選擇一個內參基因校正數據，而目前沒有一種內參基因可以適用于所有的組織和細胞，以及能夠滿足各種不同的實驗條件，如錯誤的選擇一種內參基因，可能導致實驗結果的錯誤，甚至與結論背道而馳，所以選擇2個或以上的內參基因有助于發現偏差，以確保結果準確可靠。

3 內參基因的不穩定性

GAPDH和β-actin是常選擇的內參基因，但Glare等研究發現在哮喘氣道組織中這兩個內參基因表達并不穩定，不適合作為內參校正數據[4]。Radonic等證實GAPDH和β-actin這兩個內參基因明顯地受有絲分裂原刺激的調節，表現出在實驗條件下細胞內看家基因的激活[5]。也有研究報道Let-7a在結直腸癌中表達穩定適合作為內參基，，而另有實驗證明Let-7a對結直腸癌有抑癌作用，不適合作為內參基因[6，7]。

4 內參基因穩定性分析

由于內參基因在不同實驗條件下、不同組織和細胞中表達量不同，甚至差異明顯，這為內參基因的選擇出了難題。針對這一問題，Jo Vandesompele，Claus 和 Michael等分別編寫 geNorm、NormFinder 和 BestKeeper 程序用于進行比較內參基因的表達變化和穩定性評價[8，9]，以便篩選出表達穩定的內參基因，保證實驗結果的真實性。

GeNorm程序是Jo Vandesompele于2002年編寫的專門用來篩選RT-PCR內參基因的程序，后來該程序得到進一步改進[10]，其核心原理是：無論在何種實驗條件下或何種細胞內，兩個理想內參基因表達水平的比值應該在所有標本中一致，表達水平不受基因間表達豐度差別和極端比值的影響，比值變異度的增加意味著二者中其一或全部基因表達穩定性的降低。該程序主要通過計算某一基因與其他所有基因間兩兩比值的對數轉換值的平均變異度M作為基因穩定性的評價指標， M 值越小，表示內參基因的表達越穩定，確定最穩定的內參基因，并通過對標準化因子進行配對差異分析來判定所需內參基因的最適數目[11-13]。

NormFinder程序是基于一個固定的統計學框架方差分析，通過測定每個基因的穩定值，根據穩定值的大小排序，最終將表達穩定值最小的基因作為最穩定的基因。但是它的不足之處在于只能選擇1個最合適的內參基因[14]。

BestKeeper程序可以分析基因表達穩定性和基因表達水平，它通過把原始數據輸入BestKeeper軟件的Excel表格中，對內參基因和目標基因進行單獨分析。它的優點是不僅可以分析內參基因的穩定性還可以比較目標基因的表達水平，這是GeNorm和NormFinder程序不能達到的。但BestKeeper 程序只能計算一次配對相關系數，當排除某個基因后該程序不能重新計算，這也是其不足之處。

內參基因選擇是否正確直接影響著實驗結果的準確性，這三種內參基因分析軟件分別采用不同的統計學分析方法，從不同方面幫助篩選適合的內參基因，綜合三種軟件分析的結果，可為正確選擇內參基因提供更加可靠的依據。

參考文獻

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