兩種酶法試劑盒檢測糖化白蛋白的方法學比對分析

黃迪 尚陳宇 萬澤民 王云秀 柯培鋒 黃憲章

【摘 要】 目的 Lucica-L和MAKER試劑盒檢測糖化白蛋白的一致性分析。方法 采用巢式抽樣法抽取廣州地區18～60周歲城鄉居民共3004例。同時使用Lucica GA-L試劑盒和MAKER GA試劑盒檢測入選志愿者的血清白蛋白（ALB）和糖化白蛋白（GA）濃度，采用配對t檢驗統計分析試驗結果。結果 白蛋白和糖化白蛋白濃度值在兩種廠家試劑間的檢測結果均有顯著性差異（P<0.05）。兩種試劑GA報告值相關性較好（r2=0.962），但差異亦有統計學意義（P<0.05）。偏倚為2.6%。結論 用于白蛋白和糖化白蛋白檢測的MAKER試劑盒GA結果高于Lucica-L試劑盒，但差異臨床可接受。

【關鍵詞】 糖化白蛋白 比對分析

【Abstract】 Objective To evaluate the consistence between the Lucica-L and MAKER assay kits in analyzing glycated albumin. Methods 18～60 years old residents with the amount of 3004 was collected using the Nested sampling method in Guangzhou. The ALB and GA of the volunteers were assayed using Lucica-L kits and MAKER GA kits at the same time. The results were applied comparative t-test to perform statistical analysis. Results The difference of the concentrations of ALB and GA were Significant between the two analyzing kits（P<0.05）. The final results of the two kits showed excellent correlation（r2=0.962）， but the difference was still statistical significance（P<0.05）. The bias was 2.6%. Conclusion The GA results assaying by MAKER kit were higher than Lucica-L assay kit. But the bias has clinical acceptability.

【Key words】 glycated albumin；comparison analysis

糖尿病（diabetes mellitus，DM）是以持續高血糖為基本生化特征的一種急、慢性全身性代謝性疾病。糖尿病人血糖過高引起的一系列并發癥是其致死的主要原因[1]。而血糖控制是糖尿病患者治療的主要手段，因此選擇準確的血糖監測指標尤為重要。糖化白蛋白（GA）可作為糖尿病人短期血糖控制的有效指標[2]。

GA的常規檢測尚無標準參考方法。既往GA的的測定方法包括親和色譜法、離子交換高效液相色譜法、比色法和免疫化學法。但這些方法都存在精確度差、檢測時間長等缺點[3]。目前主流方法是采用酮胺氧化酶（KAOD）的酶學檢測法[4]，該方法簡便快速、成本低廉且可減少其它蛋白對檢測結果的影響。國內、外使用較多的是日本旭化成制藥株式會社生產的Lucica-L GA檢測試劑盒。該試劑盒因其使用廣泛，準確度、精密度、溯源性以及線性等分析性能較好，已屬成熟產品。本實驗使用Lucica GA-L試劑盒和四川邁克生物科技公司生產的MAKER GA試劑盒對廣州地區成年人群GA水平進行大樣本量同步檢測，比對分析兩種試劑盒的檢測一致性。

1 資料與方法

1.1 一般資料

采用巢式抽樣法在2014年4月至11月抽取廣州市越秀、荔灣、白云、天河等城區居民及所轄農村居民中18～60周歲常住人群3021例。經初步篩查和離群值排除，獲得合格樣本數3004例。以Lucica-L試劑盒所測白蛋白濃度值為標準，將研究對象分為低（7例）、正常（2482例）、高（515例）3組。實驗經廣州中醫藥大學第二附屬醫院倫理委員會批準，研究對象均簽署知情同意書。

1.2 試驗方法

志愿者在空腹狀態下由經驗豐富的臨床醫護人員抽取無抗凝靜脈血3～5mL，分離血清后密封、冷凍保存。Lucica-L和MAKER試劑均按廠家說明書在羅氏ROCHE MODULAR PPI全自動生化分析儀上調試好。對兩套原裝試劑分別進行校準和校準確認，同時檢測各自專用質控品，確認控制值在控。根據最新EP-9a文件要求[5]，嚴格按標準比對程序進行數據整理與分析。每天取200～300份志愿者血清，每份血清樣本均分為2份，分別使用Lucica-L和MAKER試劑盒檢測ALB和GA并記錄結果。

1.3 統計學分析

采用SPSS 20.0統計軟件進行數據分析，計量資料以x±s表示。組間比較采用Kruskal-Wallis非參數秩和檢驗，兩種試劑試驗結果間均值比較采用配對t檢驗，相關性采用Pearson相關性分析。

2 結果

2.1 人群特征描述

3001例研究對象，年齡18～60周歲，平均40歲。其中男性1509人，女性1494人，男女比例與廣州市2014年人群分布無差異（P<0.05）。抽樣人群未排除任何基礎疾病、感染、家族史、妊娠狀態等。

2.2 GA、ALB濃度檢測結果

排除性別、年齡等因素，兩種試劑GA濃度值在以ALB分組的3組中，組間差異兩兩比較，均具有統計學意義（P<0.01）。每組Lucica-L與MAKER之間GA、ALB差異亦有統計學意義（P均<0.05），見表1。低值組GA和ALB結果Lucica大于MAKER，正常組和高值組GA結果MAKER明顯大于Lucica，但ALB結果MAKER偏低。

2.3 Lucica-L與MAKER試劑GA報告值的相關性及線性

以GA/ALB帶入公式得出糖化白蛋白報告值。三個組Lucica-L與MAKER之間均呈正相關，且高度相關，相關系數r2均>0.95，見圖1。所有樣本報告值匯總比較，兩種試劑間差異有統計學意義（P<0.01），報告值匯總統計見表2。

2.4 報告值比對分析

以Lucica-L實驗結果為x，以MAKER實驗結果為y，計算線性回歸方程，y=1.04x-0.22。將國際較為認可的診斷切點GA報告值（16%）代入回歸方程（見圖1之4）。計算兩者之間的系統誤差（SE）[5]，SE=|Yc-Xc|=0.42，SE%=SE/Xc×100%=2.6%。參考ALB生物學變異（3.4%），本次SE%

3 討論

目前臨床對糖尿病人血糖監控的指標主要有空腹血糖（FPG）、2小時血糖（2hPG）、糖化血清蛋白（GSP）以及糖化血紅蛋白（HbA1c）。FPG和2hPG檢測即時血糖水平，波動大且重復性低。HbA1c反映患者2-3個月之前的平均血糖濃度，時效性不佳。GSP是所有糖基化終末產物的統稱，反映患者2-3周之前的血糖控制情況。

葡萄糖能與血清中多種長半衰期蛋白質（白蛋白、血紅蛋白、胰島素、免疫球蛋白等）成分發生糖化反應，該反應是一種緩慢的非酶促結合反應，又稱為美拉德反應（Maillard reaction）。整個反應的產物稱為糖化終末產物（AGE）[6]，AGE統稱糖化血清蛋白（GSP）。GSP產物中90%以上是葡糖糖與血清白蛋白結合形成的糖化白蛋白（GA）。目前大多數醫學實驗室檢測的糖化血清蛋白都是GSP，對于腎病綜合征（nephrotic syndlome，NS）、肝硬化、異常蛋白血癥或急性時相反應之后的患者，血清白蛋白<30g/L或尿中蛋白質濃度>l.0g/L時，GSP的結果不可靠。中度溶血、膽紅素和維生素C會干擾測定。尤其低蛋白血癥和白蛋白轉化異常的患者，由于血清中非特異性還原物質也可以發生此反應，加之不同蛋白組分的非酶糖化反應率不同，導致GSP檢測法特異性較差[6]。相反GA受血液中蛋白濃度、膽紅素、乳糜和低分子物質等的影響較小[7]。實驗室應該著重發展GA檢測。

本次試驗依托本實驗室的大規模參考范圍調查課題，對比研究了進口和國產試劑盒中具有代表性的兩個廠家所生產的常規檢測試劑檢測GA的差異性。由于未排除任何基礎疾病以及個體差異等，且相關系數r2均>0.95[5]，說明分析物含量分布范圍合適，直線回歸統計的斜率和截距可靠，可認為此次大樣本的抽樣結果基本能夠代表臨床實驗室在普通人群中的檢測能力。通過試驗數據可看出，在一般人群中，GA濃度隨著ALB濃度的升高而升高，故GA的臨床報告最好應以GA/ALB計算比值，再根據不同廠家各自調整系數來表示，可排除因個體ALB差異而引起的假陽性或假陰性。這個結論也與Yoshiuchi K[8]在研究中的結果一致。從試驗中可以看出，單獨對比GA和ALB濃度值，結果差異較大。尤其是正常組和高值組，GA和ALB濃度檢測值呈現反向差異，平均值MAKER高于Lucica-L，而ALB檢測值MAKER均低于Lucica-L，GA/ALB計算值MAKER亦低于Lucica-L，差異較明顯（P均<0.01）。兩種試劑相關性亦不佳。但經過廠家說明書給出的校準公式的校正，兩種試劑盒的最終報告值明顯改善。三組樣本最終結果相關性均較好，r2均>0.95，呈顯著直線正相關。但配對t檢驗仍存在顯著差異（P<0.01），可認為MAKER檢測GA與Lucica-L相比差異有統計學意義，MAKER檢測GA偏高。因GA檢測項目未在國內廣泛開展，其允許總誤差尚無國家標準。參考ALB生物學變異[9]，本次SE%

本次試驗僅對試劑盒做出簡單比對，初步分析國產GA試劑的可用性，以為后續研究奠定基礎。接下來還將對本地區正常人群GA參考范圍、特定疾病GA檢測差異以及多中心GA檢測并將其納入DM診斷標準的可行性等做進一步深入研究。

參考文獻

[1]中華醫學會糖尿病學分會.中國2型糖尿病防治指南（2013年版）[J].中國糖尿病雜志，2014，22（8）：2-42.

[2]American Diabetes Association. Diagnosis and classification of diabetes mellitus .Diabetes care， 2010，33：s62-69.

[3]周翔海，紀立農，張秀英等.我國正常糖耐量人群糖化白蛋白的參考范圍[J].中國糖尿病雜志，2009，17（8）：572-575.

[4]村本良三.改善正確度的溴甲酚紫法的血清白蛋白測定法的開發[J].臨床化學，1997，26：38-43.

[5]Clinical and Laboratory Standards Institute. Measurement Procedure Comparison and Bias Estimation Using Patient Samples；Approved Guideline.Third Edition S 1.Wayne，PA：CISI，2013.

[6]Bry L， Chen PC， Sacks DB. Effects of hemoglobin variants and chemically modified derivatives on assays for glycohemoglobin[J]. Clin Chem， 2001， 47： 153-163.

[7]Paroni R， Ceriotti F， Galanello R， et al. Performance characteristics and clinical utility of an enzymatic method for the measurement of glycated albumin in plasma. Clin Biochem， 2007， 40：1398-1405.

[8]Yoshiuchi K， Matsuhisa M， Katakami N et al . Glycated albumin is a better indicator for glucose excursion than glycated hemoglobin in type 1 and type 2 diabetes [J]. Endocr， 55：503-507.

[9]James Westgard Founder.European Biologic Goals[DB/OL].Westgard QC，2012.

作者簡介：黃迪，男，主管技師，主要從事臨床生化檢驗研究。