人肝癌相關抗原Cdc25C特異性多肽抗體的制備及其應用

陳承曉,張琪惠,李春梅,田淋,莫發榮(北海市人民醫院，廣西北海536000；廣西醫科大學基礎醫學院)

?

·論著·

人肝癌相關抗原Cdc25C特異性多肽抗體的制備及其應用

陳承曉1,張琪惠2,李春梅2,田淋2,莫發榮2(1北海市人民醫院，廣西北海536000；2廣西醫科大學基礎醫學院)

摘要：目的制備抗人肝癌相關抗原Cdc25C特異性多肽抗體，為進一步研究Cdc25C的功能奠定基礎。方法 通過生物信息學軟件對人Cdc25C蛋白的抗原屬性進行分析，綜合考慮多肽的純度、氨基酸組成、長度、親水性和二級結構等，得到若干個同源性低、抗原性較高的候選多肽。多肽合成后與KLH佐劑偶聯，免疫新西蘭大白兔，制備相應的多克隆抗體。經ELISA和Western blotting方法鑒定其活性，并以免疫組化法檢測多肽抗體的效果。結果多肽抗體的效價較高, 特異性強。以多肽抗體對重組表達的Cdc25C融合蛋白進行Western blotting鑒定，于73 kD附近有明顯反應條帶。以全蛋白的單克隆抗體和多肽抗體檢測同一肝細胞癌癌旁組織，購買的Cdc25C單克隆抗體與制備的Cdc25C多肽多克隆抗體平均光密度分別為0.538±0.192、0.410±0.122，兩者比較差異無統計學意義(t=0.109,P>0.05)。結論 成功制備抗人肝癌相關抗原Cdc25C特異性多肽抗體；篩選獲得的候選多肽具有Cdc25C全蛋白一樣的抗原性，制備的多肽抗體具有和針對Cdc25C全蛋白抗體一樣的效果。

關鍵詞：肝腫瘤；肝癌相關抗原；Cdc25C多肽；多克隆抗體

細胞周期蛋白Cdc25C在真核生物細胞有絲分裂中起重要調節作用，其與G2/M期檢測點關鍵調控分子Cdc2/cyclin B的結合，決定細胞是否進入有絲分裂周期[1]。Cdc25C還是一個新的腫瘤相關抗原[2]。初步RT-PCR結果顯示，Cdc25C在肝細胞癌中高表達(16/30)[3]。為深入研究Cdc25C的功能區域及其在腫瘤發病、診斷和臨床免疫治療中的作用，我們于2014年采用生物信息學方法篩選出同源性低、抗原性較高的Cdc25C多肽片段，采用固相多肽合成法合成多肽，用于免疫新西蘭大白兔，制備相應的多克隆抗體。

1材料與方法

1.1材料肝細胞癌(HCC)癌旁組織來源于廣西醫科大學第一附屬醫院；完全弗氏佐劑(CFA)和不完全弗氏佐劑(IFA)購自Gibco BRL公司；Anti-Cdc25C antibody[E302]單克隆抗體購自英國Abcam公司；即用型免疫組化試劑盒和DAB試劑盒購自武漢博士德生物工程有限公司；辣根過氧化物酶標記抗兔二抗購自Rockland公司，新西蘭大白兔(2.5 kg)、TMB試劑、ELISA試劑盒和Western blotting等試劑盒由南京金斯瑞公司提供。

1.2Cdc25C特異性多肽的設計和篩選為設計出能引起預期免疫效應的抗原多肽，通過Optimum AntigenTM設計工具，對Cdc25C蛋白的屬性進行分析，以JW算法對抗原進行預測，保證抗原設計的合理性，綜合考慮多肽的純度、氨基酸組成、長度、親水性和β-轉角、β-折疊、α-螺旋等二級結構，得到若干個候選多肽片段。將之與特異性蛋白數據庫進行比對，篩選出最能引起預期免疫效應，并能將同源效應和產生非特異性反應降低到最小的三個候選多肽,起始位點分別為64、185、407，抗原決定簇序列分別為ADLDETGHLDSSGLC、CYRSPSMPENLNRPR、PMHHQDHKTELLRC。

1.3多肽抗原合成采用9-氟甲氧羰固相合成法合成多肽片段。多肽經過純化后，利用高效液相色譜法測定純度，三個候選多肽純度分別達到85.4%、89.6%、94.1%。為保證合成多肽的序列正確，我們對其進行了MS/MS質譜測序。測序結果顯示三個多肽分子序列均正確無誤。

1.4Cdc25C特異性多肽多克隆抗體的制備經馬來酰亞胺基苯甲酸琥珀酰亞胺酯活化的鑰孔戚血藍素按1∶1的比例與純化后的多肽孵育3 h進行偶聯，之后轉移到透析袋中，PBS浸泡除鹽，4 ℃過夜后，得到多肽-血藍蛋白化合物(免疫原)。取多肽-血藍蛋白化合物200 μg溶于250 μL的PBS(0.1 mol/L pH 7.4 )，與等體積的完全弗氏佐劑充分混勻乳化后, 對新西蘭大白兔皮下多點注射。以后以不完全弗氏佐劑取代完全弗氏佐劑，每2周免疫1次，共接種6次。每次免疫后的第 10～14天，從兔耳靜脈采血測定抗體效價，直至獲得滿意的抗體效價，制備出相應的兔抗血清。

1.5Cac25C特異性多克隆抗體效價測定采用ELISA法檢測Cdc25C特異性多肽多克隆抗體的效價，根據信噪比S/N>2.1(S/N=2為最小檢出限)確定三個多肽抗體滴度。

1.6Cdc25C特異性多肽多克隆抗體的應用以購買英國Abcam公司的Anti-Cdc25C antibody[E302]單克隆抗體和制備的特異性多肽多克隆抗體對重組表達的TRx-His-Cdc25C融合蛋白進行Western blotting鑒定。采用免疫組化法，以購買的單克隆抗體與制備的多肽抗體檢測同樣的HCC癌旁組織，切片經病理圖像分析系統拍照后用圖像分析軟件Image-pro plus 6.0獲得陽性反應顆粒的平均光密度值(光密度值越高說明陽性反應越強，可進行定量分析)。

2結果

2.1多克隆抗體的效價三個候選多肽制備的多克隆抗體滴度分別達到1∶16 000、1∶16 000和1∶32 000。

2.2Cdc25C特異性多肽多克隆抗體的應用效果以購買的單克隆抗體(圖1-A)和制備的特異性多肽多克隆抗體(圖1-B)進行Western blotting檢測，結果均在73 kD附近有明顯反應條帶(TRx-His相對分子質量約20 kD，Cdc25C相對分子質量約53 kD)。上述兩種抗體在免疫組化染色中的平均光密度分別為0.538±0.192、0.410±0.122，兩者比較差異無統計學意義(t=0.109,P>0.05)。制備的多肽多克隆抗體具有和針對Cdc25C全蛋白的單克隆抗體等同的效果，篩選出來的多肽能代表Cdc25C全蛋白的抗原性。

注：M為ProteinRulerTM ⅡMarker；1、2為原核表達的Cdc25C融合蛋白。

圖1 Western blotting法檢測Cdc25C抗體效果

3討論

細胞周期蛋白Cdc25C或其剪接體在HCC、結腸癌、前列腺癌和黑色素瘤等多種惡性腫瘤組織或細胞株中過度表達，并參與G2/M檢測點調控[4]，G2/M檢測點與腫瘤發生、應答相關,所以Cdc25C可能是腫瘤治療的潛在靶點[5]。梁馬可等[6]實驗表明，Cdc25C在HCC組織、癌旁組織、正常肝臟組織表達陽性率分別為86.2%、45.8%、11.1%，三種組織中的表達差異均有統計學意義；Cdc25C在HCC 組織中的表達與HBsAg、腫瘤直徑和腫瘤分化程度有關(P<0.05)。在肝癌細胞中，一種翻譯控制腫瘤蛋白能促進Cdc25C的泛素化降解，從而引起周期蛋白激酶1的Tyr15位點去磷酸化的失敗。使Cdk1活性下降從而引起有絲分裂的停滯，造成染色體畸形，而染色體畸形是腫瘤發展中的一個重要環節[7]。最近還有研究人員發現雙氫青蒿素通過誘導p21、抑制cyclin B和蛋白Cdc25C，引起G2/M期阻滯，從而顯著抑制體外、體內肝癌細胞生長[8]。

為進一步研究Cdc25C在細胞中的功能及其與腫瘤細胞惡性增殖的關系，開展抗體血清學檢測、抗體制備及其相關的研究，開發和應用Cdc25C全蛋白抗原疫苗和肽表位疫苗，我們利用JW算法對Cdc25C的親水性及抗原性分析，結果提示該蛋白抗原性較好, 其可能抗原表位主要在氨基端殘基的部分區域。經過折疊可能性預測和同源性檢索后，選取折疊可能性較低，同源性亦較低，同時親水性與抗原性較高的64～78、185～199、407～421三個區域肽段，采用固相合成法合成多肽。為加強免疫原性，在其C末端加上谷氨酸和絲氨酸，然后與KLH偶聯作為免疫原, 免疫新西蘭大白兔制備了多克隆抗體。通過ELISA分析, 結果顯示制備出的多克隆抗體滴度高，特異性好。

本實驗制備的抗體是由多肽-血藍蛋白復合物作為免疫原，激起免疫反應產生，包含了針對多肽、連接劑和載體蛋白的多克隆抗體。以該多克隆抗體對重組表達的Cdc25C融合蛋白進行Western blotting鑒定，于73 kD附近有明顯反應條帶，和前期研究[ 9]結果相符，說明其免疫原性是針對Cdc25C特異性多肽產生的。以全蛋白的單克隆抗體和多肽抗體檢測同一HCC癌旁組織，陽性反應顆粒主要位于肝細胞的細胞質，兩種抗體陽性染色結果經統計分析無統計學差異。我們篩選獲得的候選多肽具有Cdc25C全蛋白一樣的抗原性，制備的多肽抗體具有和針對Cdc25C全蛋白抗體一樣的效果，此為進一步研究Cdc25C的功能區域奠定了基礎。

參考文獻：

[1] Perdiguero E, Nebreda AR. Regulation of Cdc25C activity during the meiotic G2/M transition[J]. Cell Cycle, 2004,3(6):733-737.

[2] Wang X, Zhao H, Xu Q, et al. HPtaa database-potential target genes for clinical diagnosis and immunotherapy of human carcinoma[J]. Nucleic Acids Res, 2006,34(Database issue):D607-D612.

[3] 莫發榮.細胞周期蛋白Cdc25C的研究[J].生命的化學,2010,30(6):889-892.

[4] Albert H, Santos S, Battaglia E, et al. Differential expression of CDC25 phosphatases splice variants in human breast cancer cells[J]. Clin Chem Lab Med, 2011,49(10):1707-1714.

[5] Wang Z, Trope CG, Fl?renes VA, et al. Overexpression of CDC25B, CDC25C and phospho-CDC25C(Ser216) in vulvar squamous cell carcinomas are associated with malignant features and aggressive cancer phenotypes[J]. BMC Cancer, 2010,10:233.

[6] 梁馬可,李仁鋒,夏曉博,等.CDC25C蛋白和CLDN6蛋白在肝細胞癌中的表達及臨床意義[J].河南醫學研究,2013,22(6):807-811.

[7] Chan TH, Chen L, Liu M, et al. Translationally controlled tumor protein induces mitotic defects and chromosomemissegregation in hepatocellular carcinoma development[J]. Hepatology, 2012,55(2):491-505.

[8] Zhang CZ, Zhang H, Yun J, et al. Dihydroartemisinin exhibits antitumor activity toward hepatocellular carcinoma invitro and in vivo[J]. Biochem Pharmacol, 2012,83(9):1278-1289.

[9] 卓少元,陳承曉,鐘衛干,等.人Cdc25C基因克隆及其原核表達載體的構建與表達[J].世界華人消化雜志,2014,22(15):2140-2144.

Preparation and application of human HCC-associated antigen Cdc25C specific peptide antibody

CHENChengxiao1,ZHANGQihui,LIChunmei,TIANLin,MOFarong

(1BeihaiPeople'sHospital,Beihai536000,China)

Abstract:ObjectiveTo prepare polyclonal antibody against human hepatocellular carcinoma (HCC)-associated antigen Cdc25C specific polypeptide, and to lay a foundation for further study of the function of Cdc25C. Methods The properties of Cdc25C protein antigen were analyzed by bioinformatics software. Several candidate partial peptides of low homology and high antigenicity were designed based on the purity, amino acid composition, length, hydrophilic and secondary structure. Three partial peptides of Cdc25C were synthesized. The synthesized peptide was then used to immunize after coupling with KLH. The activity of anti-Cdc25C antibody was analyzed by ELISA and Western blotting, and its effect was detected by immunohistochemistry. ResultsThe polypeptide antibody had high titer and specificity. The antibody identified against recombinant Cdc25C fusion protein by Western blotting, and the reaction bands appeared at 73 kD. We used the whole protein monoclonal antibody and peptide antibody to detect the same HCC cancer adjacent tissue, and its average optical density was 0.538±0.192 and 0.410±0.122, respectively, no significant difference was found between them (t=0.109, P>0.05). ConclusionPolyclonal antibody against human HCC-associated antigen Cdc25C specific polypeptide is successfully prepared. The candidate peptides obtained from the screening have the same antigenicity as Cdc25C whole protein, and the prepared polypeptide antibody has the same effect as the antibody against the Cdc25C whole protein.

Key words:liver neoplasms; hepatocellular carcinoma-associated antigen; Cdc25C polypeptide; polyclonal antibody

(收稿日期：2016-01-21)

中圖分類號：R575

文獻標志碼：A

文章編號：1002-266X(2016)13-0001-03

doi：10.3969/j.issn.1002-266X.2016.13.001

通信作者簡介：莫發榮(1972-)，男，碩士，副教授，主要研究方向為腫瘤免疫。E-mail:farongmo@126.com

第一作者簡介：陳承曉(1978-)，女，碩士，助理實驗師，主要研究方向為腫瘤免疫。E-mail：2494255044@qq.com

基金項目：國家自然科學基金資助項目(81160264)。