骨肉瘤組織p53、鼠雙微體2蛋白表達及意義

秦曉飛，韓志，張勇勇，郭建剛，張志勇，黃滿玉

(河南省洛陽正骨醫(yī)院，河南洛陽471002)

·臨床研究·

骨肉瘤組織p53、鼠雙微體2蛋白表達及意義

秦曉飛，韓志，張勇勇，郭建剛，張志勇，黃滿玉

(河南省洛陽正骨醫(yī)院，河南洛陽471002)

目的 觀察骨肉瘤患者癌組織p53、鼠雙微體2(MDM2)蛋白表達變化，并探討其與化療療效、預(yù)后的關(guān)系。方法 選擇新輔助化療前的骨肉瘤患者39例，取其活檢獲得的骨肉瘤組織及腫瘤周圍正常骨組織，采用免疫組化法檢測p53、MDM2蛋白表達。患者經(jīng)新輔助化療及手術(shù)后取其腫瘤組織，HE染色后以腫瘤壞死率評價化療敏感性。分析骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達與患者臨床病理參數(shù)(性別、年齡、組織學(xué)類型、化療敏感性)及無病生存時間(DFS)的關(guān)系。結(jié)果 39例患者術(shù)前活檢腫瘤組織中p53蛋白陽性表達率為23.1%(9/39)，MDM2蛋白陽性表達率為76.9%(30/39)，腫瘤周圍正常骨組織中均未見p53、MDM2蛋白陽性表達；兩者比較P均<0.05。39例患者中，腫瘤壞死率<90%者27例，對化療敏感性低；≥90%者12例，對化療敏感性高。化療敏感性低者腫瘤組織p53、MDM2蛋白陽性表達率明顯高于化療敏感性高者(P均<0.05)；腫瘤組織p53、MDM2蛋白陽性表達率與患者性別、年齡、組織學(xué)類型均無關(guān)(P均>0.05)。腫瘤組織p53蛋白陰性與陽性表達者DFS分別為34.0(18.8，42.0)、12.0(9.0，17.0)個月，兩者比較P<0.05；MDM2蛋白陰性與陽性表達者DFS分別為53.0(42.0，63.5)、18.5(12.0，34.0)個月，兩者比較P<0.05。結(jié)論 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白陽性表達率升高，可導(dǎo)致患者化療敏感性降低及預(yù)后不良。

骨肉瘤；p53；鼠雙微體2；化療敏感性；腫瘤壞死率；預(yù)后

骨肉瘤是青少年原發(fā)性惡性骨腫瘤中發(fā)病率最高的腫瘤之一[1]，自1982年Rosen引入新輔助化療后，骨肉瘤的5年生存率明顯提高，達到70%～80%[2]，但是仍有20%～30%的患者對新輔助化療不敏感，預(yù)后較差。在手術(shù)及化療前尋找合適的標記物來區(qū)分這些患者，有助于臨床盡早采取其他有效治療措施，從而提高骨肉瘤患者的總生存率[3，4]。p53、鼠雙微體2(MDM2)與多種腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)，但其是否可預(yù)測骨肉瘤患者的化療敏感性及預(yù)后少見報道。為此，我們進行了如下研究。

1 資料與方法

1.1 臨床資料 選擇2009年1月～2015年1月我院收治的骨肉瘤患者39例，男23例、女16例，年齡11～64歲、平均28歲，病程15天～18個月；組織學(xué)類型：低級別型8例(髓內(nèi)高分化骨肉瘤5例、皮質(zhì)旁骨肉瘤3例)，普通型31例。納入標準：①經(jīng)術(shù)前病理穿刺確診為骨肉瘤；②穿刺前未經(jīng)放療、化療及藥物治療；③于我院擬采取新輔助化療后手術(shù)治療。排除標準：①合并除骨肉瘤以外的其他惡性腫瘤。②合并嚴重的心肝腎等系統(tǒng)性疾病。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會批準，患者均知情同意。

1.2 腫瘤組織p53、MDM2蛋白表達檢測 采用免疫組化法。取患者術(shù)前活檢得到的腫瘤組織及腫瘤周圍正常骨組織，常規(guī)石蠟包埋，5 μm厚度切片。脫蠟水化，磷酸緩沖液沖洗，滴加p53、MDM2一抗，4 ℃過夜；磷酸緩沖液沖洗，滴加二抗，37 ℃孵育20 min；磷酸緩沖液沖洗，DAB顯色；自來水充分沖洗，復(fù)染，脫水透明，封片。鼠抗人單克隆抗體MDM2購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，鼠抗人p53單克隆抗體、Envision試劑盒購自福州邁新生物技術(shù)開發(fā)有限公司，嚴格按照試劑盒說明書進行操作。p53蛋白、MDM2蛋白陽性為細胞核著色，呈棕黃色。隨機選擇5個高倍視野，計算每個高倍鏡視野內(nèi)陽性細胞占所有腫瘤細胞的百分比，取平均值。p53、MDM2陽性細胞比例>10%定義為陽性，≤10%定義為陰性，計算陽性表達率。

1.3 新輔助化療效果判斷及手術(shù)方法選擇 患者均接受甲氨蝶呤、阿霉素、順鉑、長春新堿和異環(huán)磷酰胺的經(jīng)典方案，進行新輔助化療1個周期。化療結(jié)束行CT或MRI檢查，根據(jù)原發(fā)病灶變化情況評價新輔助化療效果，并預(yù)計手術(shù)切緣及術(shù)后肢體功能。對預(yù)期可獲得陰性切緣并保留可接受術(shù)后肢體功能者行保肢手術(shù)，術(shù)后再行輔助化療；對由于腫瘤進展預(yù)計無法獲得陰性切緣或切除腫瘤后殘留功能不優(yōu)于假肢者行截肢手術(shù),術(shù)后再行輔助化療。手術(shù)切除后的標本根據(jù)Eaneking等[5]的方法進行邊界判斷：囊內(nèi)切除和邊緣切除為邊界不足，廣泛切除和根治切除為邊界足夠。本研究患者均為廣泛切除，具有足夠的邊界。

1.4 術(shù)后化療敏感性評估 取患者術(shù)中切除的骨肉瘤組織，將其沿腫瘤最大截面處剖開，斷面上應(yīng)用網(wǎng)格劃分出若干小塊(根據(jù)腫瘤大小可劃分20～40塊)，每一小塊加以編號。經(jīng)10%甲醛固定，常規(guī)脫水，石蠟包埋，3 μm厚度連續(xù)切片。脫蠟后分別進行HE染色，梯度乙醇脫水，二甲苯透明后封片。將每一小塊封好的切片自然干燥，根據(jù)其大小分成若干視野，分別計算每一小塊標本的腫瘤壞死率，取平均值得出整個腫瘤斷面的腫瘤壞死率。參照Huvos等[6]的方法，腫瘤壞死率<90%表示化療敏感性低，≥90%表示化療敏感性高。

1.5 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 采用Fisher′s精確概率法分析術(shù)前活檢骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達與患者臨床病理特征(性別、年齡、組織學(xué)類型及化療敏感性)的關(guān)系。

1.6 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達與患者無病生存時間(DFS)的關(guān)系 術(shù)后隨訪，記錄患者的DFS，即從手術(shù)開始至第1次復(fù)發(fā)或轉(zhuǎn)移的時間。分析術(shù)前骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達與DFS的關(guān)系。

1.7 統(tǒng)計學(xué)方法 采用SPSS17.0統(tǒng)計軟件。不符合正態(tài)分布的計量資料以M(P25，P75)表示，結(jié)果比較采用秩和檢驗；計數(shù)資料以率表示，結(jié)果比較采用Fisher′s精確概率法。P<0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 組織p53、MDM2蛋白表達 39例患者術(shù)前活檢腫瘤組織中p53蛋白陽性表達9例(23.1%)，陰性表達30例(76.9%)；MDM2蛋白陽性表達30例(76.9%)，陰性表達9例(23.1%)；腫瘤周圍正常骨組織p53、MDM2蛋白均為陰性表達；術(shù)前活檢腫瘤組織p53、MDM2蛋白陽性表達率均高于腫瘤周圍正常骨組織(P均<0.05)。

2.2 化療敏感性 39例患者中，腫瘤壞死率<90%者27例，對化療敏感性低；≥90%者12例，對化療敏感性高。

2.3 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達與患者臨床病理特征的關(guān)系 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達與患者性別、年齡、組織學(xué)類型均無關(guān)(P均>0.05)。化療敏感性低者腫瘤組織p53、MDM2蛋白陽性表達率明顯高于化療敏感性高者(P均<0.05)。見表1。

表1 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達與患者 臨床病理特征的關(guān)系

2.4 骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白表達與患者DFS的關(guān)系 術(shù)后隨訪時間3～79個月，中位隨訪時間28個月。腫瘤組織p53蛋白陰性及陽性表達者DFS分別為34.0(18.8，42.0)、12.0(9.0，17.0)個月，兩者比較P<0.05；MDM2蛋白陰性及陽性表達者DFS分別為53.0(42.0，63.5)、18.5(12.0，34.0)個月，兩者比較P<0.05。

3 討論

骨肉瘤患者接受化療前如能預(yù)測其化療敏感性，將有助于改善治療方案。近年來，預(yù)測新輔助化療療效標志物的研究較多，戴閩等[7]研究表明,骨肉瘤中P-糖蛋白、Survivin的表達情況對化療療效均有一定的預(yù)測價值,其中Survivin價值更高。p53基因位于染色體17p13.1，是細胞生長周期的負調(diào)節(jié)因子，與細胞周期調(diào)控、DNA修復(fù)、細胞分化、細胞凋亡等生物學(xué)功能有關(guān)。p53分野生型和突變型兩種，野生型p53蛋白極不穩(wěn)定，半衰期20～30 min，具有抑癌作用，而免疫組化和原位雜交技術(shù)檢測到的實際是突變型p53蛋白，具有癌基因作用[8]。本研究39例患者腫瘤組織p53蛋白陽性表達率明顯高于腫瘤周圍正常骨組織，且p53蛋白陰性表達者DFS明顯長于陽性表達者。提示p53突變在骨肉瘤的發(fā)生及發(fā)展中發(fā)揮重要作用，骨肉瘤患者腫瘤組織p53蛋白陽性表達率升高與其預(yù)后差有關(guān)。

MDM2是目前為止發(fā)現(xiàn)的最強的凋亡抑制因子之一，是一種與惡性腫瘤發(fā)生密切相關(guān)的癌基因，其編碼的蛋白質(zhì)可與p53蛋白結(jié)合，導(dǎo)致具有抑癌基因作用的野生型p53失活，下調(diào)細胞內(nèi)p53水平，從而使其形成負反饋調(diào)節(jié)環(huán)，精密調(diào)節(jié)細胞內(nèi)p53水平，使細胞轉(zhuǎn)化、增殖和惡變的能力增強[9，10]。近年來，已在多種人類腫瘤中證實MDM2蛋白基因突變、擴增、過表達與患者的預(yù)后不良有關(guān)[11，12]。本研究39例患者腫瘤組織MDM2蛋白陽性表達率明顯高于腫瘤周圍正常骨組織，且MDM2蛋白陰性表達者DFS明顯長于陽性表達者。提示MDM2在骨肉瘤發(fā)生發(fā)展中起重要作用， MDM2蛋白陽性表達率升高與患者預(yù)后差有關(guān)。另外，MDM2的小分子拮抗劑如Nutlin-3、RG7112、SAR405838等，能夠抑制MDM2與p53的結(jié)合，釋放出p53并恢復(fù)其功能，從而達到治療腫瘤的目的[13～15]。因此，MDM2可作為骨肉瘤治療的一個潛在靶點。

病理組織學(xué)觀察腫瘤壞死率是判斷化療敏感性及患者預(yù)后的金標準，也是指導(dǎo)術(shù)后化療的重要指標[16～18]。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白陽性表達率與患者性別、年齡、組織學(xué)類型均無關(guān)，而化療敏感性低者p53、MDM2蛋白陽性表達率均明顯高于化療敏感性高者。提示骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白陽性表達率升高與患者化療敏感性降低有關(guān)。本研究結(jié)果顯示，術(shù)前腫瘤組織p53、MDM2蛋白陰性表達者DFS明顯長于陽性表達者，表明p53、MDM2蛋白參與了骨肉瘤病程的推進，與骨肉瘤患者的不良預(yù)后密切相關(guān)，可作為評估患者預(yù)后的重要指標。

綜上所述，骨肉瘤組織p53、MDM2蛋白陽性表達率升高，與患者化療敏感性降低及預(yù)后不良有關(guān)。參考文獻：

[1] Mirabello L, Troisi RJ, Savage SA. Osteosarcoma incidence and survival rates from 1973 to 2004: data from the surveillance, epidemiology and end results program[J]. Cancer, 2009,115(7):1531-1543.

[2] Hayden JB, Hoang BH. Osteosarcoma basic science and clinical implications[J].Qrthop Clin North Am, 2006,37(1):1-7.

[3] Bielack SS, Kempf-Bielack B, Delling G, et al. Prognostic factors in high-grade osteosarcoma of the extremities or trunk: an analysisof 1702 Patients treated on neoadjuvant cooperative osteosarcoma study group protocols[J]. J Clin Oncol, 2002,20(3):776-790.

[4] Wong RP, Tsang WP, Chau PY, et al. p53-R273H gains new function in induction of drug resistance through down-regulation of ProcasPase-3[J]. Mol Cancer Ther, 2007,6(3):1054-1061.

[5] Eaneking WF, Spanier SS, Goodman MA. A system for the surgical staging of musculoskeletal sarcoma.1980[J]. Clin Orthop Relat Res, 2003(415):4-18.

[6] Huvos AG, Rosen G, Marcove RC. Primary osteogenic sarcoma：pathologic aspects in 20 patients after treatment with chemotherapy eabloc resection, and prosthetic bone replacement[J]. Arch Pathol Lab Med, 1977,101(1):14-18.

[7] 戴閩,聶濤,萬細珍,等.骨肉瘤中P-糖蛋白、Survivin的表達與化療療效的關(guān)系[J].中國矯形外科雜志,2006,14(9):687-689.

[8] Levine AJ, Momannd J, Finlay CA. The p53 tumor suppressor gene[J]. Natrue, 1991,351(6326):453-456.

[9] Bose I, Ghosh B. The p53-MDM2 network from oscillations to apoptosis[J]. J Biosci, 2007,32(5):991-997.

[10] Moll UM, Petrenko O. The MDM2-p53 interaction[J]. Mol Cancer Res, 2003,1(14):1001-1008.

[11] Hong Y, Miao X, Zhang X, et al. The role of p53 and MDM2 polymorphisms in the risk of edophageal squamous cell carcinoma[J]. Cancer Res, 2005,65(20):9582-9587.

[12] Kim SH, Kim JW, Kim YT, et al. Prognostic factors and expression of p53 and mdm-2 in uterine sarcomas[J]. Int J Gynaecol Obstet, 2006,95(3):272-277.

[13] Zhang F, Throm SL, Murley LL, et al. MDM2 antagonist nutlin-3a reverses mitoxantrone resistanceby inhibiting breast cancer resistance protein mediated drug transport[J]. Biochem Pharmacol, 2011,82(1):24-34.

[14] Tovar C, Graves B, Packman K, et al. MDM2 small-molecule antagonist RG7112 activates p53 signaling and regresses human tumors in preclinical cancer models[J]. Cancer Res, 2013,73(8):2587-2597.

[15] Hoffman-Luca CG, Yang CY, Lu J, et al. Significant differences in the development of acquired resistance to the MDM2 inhibitorSAR405838 between in vitro and in vivo drug treatment[J]. PLoS One, 2015,10(6):1371.

[16] Petitjean A, Mathe E, Kato S, et al. ImPact of mutant p53 functional ProPerties on Tp53 mutation Patternsand tumor PhenotyPe: lessons from recent develoPments in the IARC Tp53 database[J]. Hum Mutat, 2007,28(6):622-629.

[17] Zhou M, Gu L, Abshire TC, et al. Incidence and Prognostic signiflcance of MDM2 oncoProtein overexPression in relaPsed childhood acute lymPhoblastic leukemia[J]. Leukemia, 2000,14(1)61-67.

[18] Alarcon-Vargas D, Ronai Z. p53-Mdm2 the affair that never ends[J]. Carcinogenesis, 2002,23(4):541-547.

河南省中醫(yī)藥科學(xué)研究專項課題(2013ZY04050)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.013

R738.1

B

1002-266X(2016)32-0041-03

2015-12-15)