神經生長因子對大鼠脛骨骨折愈合的影響及其機制

劉建軍，黃亮，韓慶斌，李新志，闕祥勇

(三峽大學仁和醫院，湖北宜昌443001)

·基礎研究·

神經生長因子對大鼠脛骨骨折愈合的影響及其機制

劉建軍，黃亮，韓慶斌，李新志，闕祥勇

(三峽大學仁和醫院，湖北宜昌443001)

目的 觀察神經生長因子(NGF)對大鼠脛骨骨折愈合的影響，并探討其相關機制。方法 將60只脛骨骨折模型大鼠隨機分為觀察組和對照組，每組30只。觀察組于造模后第2天開始肌注NGF 200 ng/kg，1次/d，連用2周。對照組以相同的方法肌注等量生理鹽水。兩組治療后1周(T0)、2周(T1)、4周(T2)行脛骨X線檢查，采用Perkins法計算骨痂體積；稱量全長脛骨濕重，采用RT-PCR法檢測骨痂組織胰島素樣生長因子-1(IGF-1)mRNA相對表達量。結果 隨術后時間延長，兩組骨痂體積及全長脛骨濕重均逐漸增加。兩組T0、T1時間點骨痂體積及全長脛骨濕重比較均無統計學差異(P均>0.05)；觀察組T2時間點骨痂體積及全長脛骨濕重明顯高于對照組，T0、T1時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量均明顯高于對照組(P<0.05或<0.01)；兩組T2時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量比較無統計學差異(P均>0.05)。結論 NGF可促進大鼠脛骨骨折的愈合，可能與其促進骨折愈合過程中骨痂組織IGF-1表達有關。

脛骨骨折；骨折愈合；神經生長因子；胰島素樣生長因子-1；大鼠

神經生長因子(NGF)是一種神經營養因子，與一些細胞因子之間存在協同效應，對骨折愈合具有一定的促進作用，但是其作用機制尚不完全清楚[1，2]。胰島素樣生長因子-1(IGF-1)是由骨組織分泌的一種生長因子，對成骨細胞增殖和分化具有促進作用，既可作用于局部，又可作用于全身[3]。臨床上關于NGF促進骨折愈合的機制是否與IGF-1有關尚不明確。2014年7～9月，我們對脛骨骨折大鼠給予NGF治療，觀察其對骨折愈合的影響，并探討相關機制。現報告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 健康雄性SD大鼠60只，10周齡，體質量(260±20)g，由三峽大學實驗動物中心提供。試劑及儀器：注射用NGF購于廈門北大之路生物工程有限公司，RT-PCR試劑盒購于大連寶生物工程有限公司，總RNA分離試劑、DNA Marker購于天根生化科技(北京)有限公司，瓊脂糖購于美國BIO-RAD公司；電子天平購于上海市第二天平儀器廠，PCR儀購于德國Biometra公司，凝膠成像分析系統購于美國Kodak公司。

1.2 脛骨骨折模型制備及分組處理 60只大鼠均建立脛骨骨折模型：5%水合氯醛腹腔注射麻醉。右后肢脫毛、消毒，于小腿中上1/3處行前正中切口，長約1.5 cm。切開皮膚、皮下組織及筋膜，扒開脛前肌，于脛骨結節下1.0 cm處橫形切斷脛骨。以1.0 mm克氏針經遠端髓腔穿出，復位后逆行打入骨折近端。生理鹽水沖洗，逐層關閉切口。術后肌注青霉素10萬U，連用3天。將脛骨骨折模型大鼠隨機分為觀察組及對照組，每組30只。觀察組于造模后第2天肌注NGF 200 ng/kg，注射部位為兩側腓腸肌，1次/d，連用2周。對照組以相同的方法肌注等量生理鹽水。

1.3 相關指標觀察

1.3.1 骨痂體積 治療后1周(T0)、2周(T1)、4周(T2)，兩組于麻醉狀態下行脛骨X線檢查，采用DR閱片的PACS系統測量骨半徑、骨痂半徑、骨痂長度(分別記為r1、r2、L，單位mm)，攝片和指標測量均由兩位醫生按照雙盲原則進行操作。采用Perkins法計算骨痂體積，即V= 2πr1( r2-r1)L。

1.3.2 全長脛骨濕重 兩組分別于T0、T1、T2時間點隨機選取10只大鼠，麻醉狀態下處死。取其全長脛骨，標本采集時注意保護骨折附近區域組織，以免破壞骨痂組織。去除內固定物，用天平稱量全長脛骨濕重。

1.3.3 骨痂組織IGF-1 mRNA表達 采用RT-PCR法。各組稱量脛骨全長濕重后，于骨折處上、下各2 mm取骨痂組織，液氮凍存。將骨痂組織研磨勻漿后，以TRIzol試劑一步法提取細胞總RNA，隨后進行反轉錄。引物由上海生工生物工程股份有限公司合成，IGF-1上游引物：5′-CTTTGCGGGGCTGAGCT-3′，下游引物：5′-CTTCAGCGGAGCACAGT-3′，片段長度：184 bp；以GAPDH為內參，上游引物：5′-CACCCTGTTGCTGTAGCCATATTC′，下游引物：5′-GACATCAAGAAGGTGGTGAAGCAG-3′，片段長度：196 bp。PCR擴增條件：94 ℃、5 min，94 ℃、45 s，54 ℃、45 s，72 ℃、45 s，72 ℃、6 min，共29個循環。采用凝膠成像分析系統檢測條帶的單位面積光密度值(OD值)，以真彩色醫學圖像分析軟件(Image-proplus6.0)對結果進行半定量分析，以目的基因與內參基因OD值的比值計算mRNA相對表達量。

2 結果

2.1 兩組各時間點骨痂體積比較 隨術后時間延長，兩組骨痂體積均逐漸增大。兩組T0、T1時間點骨痂體積比較無統計學差異(P均>0.05)，觀察組T2時間點骨痂體積明顯大于對照組(P<0.05)。見表1。

表1 兩組各時間點骨痂體積比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

2.2 兩組各時間點全長脛骨濕重比較 隨術后時間延長，兩組全長脛骨濕重均逐漸增加。兩組T0、T1時間點全長脛骨濕重比較無統計學差異(P均>0.05)，觀察組T2時間點全長脛骨濕重明顯高于對照組(P<0.05)。見表2。

表2 兩組各時間點全長脛骨濕重比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05。

2.3 兩組各時點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量比較 觀察組T0、T1時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量均明顯高于對照組(P<0.05或<0.01)，兩組T2時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量比較無統計學差異(P>0.05)。見表3。

表3 兩組各時點骨痂組織IGF-1 mRNA 相對表達量比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.05，#P<0.01。

3 討論

骨折愈合是一個復雜的骨再生過程，除了需要適當的生物力學環境外，多種組織、細胞及各種細胞因子之間的相互作用在骨折愈合過程中也發揮重要作用。隨著高能量損傷和開放性損傷發生率的升高，骨折不愈合患者數量逐年增加。盡管眾多新觀念、新技術已經廣泛應用于臨床中，但目前骨折不愈合的治療仍然面臨著許多難題。

研究顯示，合并中樞神經損傷的骨折患者愈合速度明顯加快，骨痂生成也明顯增多[4]。Bidner 等[5]研究認為，在機體的中樞神經受到損傷后，某些生長因子能夠透過血腦屏障釋放出來，作用于骨折局部而發揮作用。因此，以NGF為代表的神經營養因子在骨折愈合中的作用受到了廣泛關注。NGF是最初發現能夠促進神經細胞生長的一種因子，其作為治療神經系統疾病的藥物已經廣泛應用于臨床。隨著研究的不斷深入，NGF促進骨折愈合的作用也逐漸得到證實[6～9]。Grills等[10]研究發現，在骨折斷端局部注射NGF后骨痂生成明顯增多，骨痂剛度和抗折彎強度也顯著增加。研究證實，NGF不僅可誘導神經纖維長入骨痂，還能刺激機體釋放P物質、降鈣素基因相關肽等神經肽類物質，而這些肽類物質能抑制骨吸收，促進成骨作用，對骨折的修復具有促進作用[11]。NGF能促進血管內皮細胞分化，加速毛細血管的形成，改善骨折處的血液供應；還可刺激骨細胞增殖分化，提高成骨細胞活性，是其促進骨折愈合的一條重要途徑[11]。本研究結果顯示，隨術后時間延長，兩組骨痂體積及全長脛骨濕重均逐漸增加，但觀察組T2時間點骨痂體積及全長脛骨濕重明顯高于對照組，說明NGF對大鼠脛骨骨折的愈合具有促進作用。

IGF-1是一種在骨細胞中含量豐富的生長因子，對成骨細胞功能具有重要的調節作用[12]，可增加成骨細胞和骨髓基質細胞的增殖和分化能力，減少骨膠原退化，增加骨質沉積；還能促進骨基質合成鈣化，具有加速骨折愈合的作用[13]。本研究觀察組T0、T1時間點骨痂組織IGF-1 mRNA相對表達量均明顯高于對照組，說明NGF可能通過刺激 IGF-1的分泌而增強骨細胞的增殖分化，可能是NGF能夠促進骨折愈合的重要機制之一。

綜上所述，NGF對大鼠脛骨骨折的愈合具有促進作用，提高骨痂組織IGF-1表達有關可能是其作用機制。

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三峽大學青年基金資助項目(KJ2012A020)。

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.008

R687.3

A

1002-266X(2016)32-0027-03

2015-11-24)