miR-33a-5p對骨肉瘤細胞Saos-2增殖的影響及其機制

袁忠，胡俊，雷家維，付璐珩，俞曾強，汪海燕

(江西中醫藥大學附屬洪都中醫院，南昌330006)

miR-33a-5p對骨肉瘤細胞Saos-2增殖的影響及其機制

袁忠，胡俊，雷家維，付璐珩，俞曾強，汪海燕

(江西中醫藥大學附屬洪都中醫院，南昌330006)

目的 觀察miR-33a-5p對骨肉瘤細胞Saos-2增殖的影響，并探討其相關機制。方法 采用Real time-PCR法檢測骨肉瘤細胞Saos-2及正常人成骨細胞hFOB1.19中miR-33a-5p mRNA相對表達量。將對數生長期的骨肉瘤細胞Saos-2分為兩組，分別轉染miR-33a-5p mimics(mimics組)及Scramble(對照組)。采用MTT法檢測兩組培養24、48、72、96及120 h細胞增殖能力，細胞克隆形成實驗檢測細胞克隆形成能力(以克隆形成率表示)，流式細胞術比較細胞周期，Westen blotting法檢測細胞周期蛋白激酶2(CDK2)、CDK4、細胞周期蛋白D(CyclinD)及CyclinE蛋白相對表達量。結果 骨肉瘤細胞Saos-2及正常人成骨細胞hFOB1.19中miR-33a-5p mRNA相對表達量分別為2.65±0.43和24.32±3.21，兩者比較P<0.01。隨著培養時間延長，兩組細胞增殖能力均呈升高趨勢；與對照組同時間點比較，mimics組細胞增殖能力均降低(P均<0.01)。mimics組和對照組克隆形成率分別為25.34%±3.46%、53.27%±5.82%,兩組比較P<0.01。mimics組和對照組分別有46.37%±4.28%、30.64%±3.52%的細胞處于G1期，分別有13.25%±1.25%、22.62%±2.01%的細胞處于G2期，兩組比較P均<0.01。mimics組CDK2、CDK4、CyclinD、CyclinE蛋白相對表達量均低于對照組(P均<0.01)。結論 骨肉瘤細胞Saos-2中miR-33a-5p表達降低，上調其表達可抑制細胞增殖；下調 CDK2、CDK4、Cyclin D及Cyclin E等細胞周期相關蛋白的表達可能為miR-33a-5p的作用機制。

骨肉瘤；Saos-2細胞；miR-33a-5p；細胞增殖

骨肉瘤好發生于股骨遠端、脛骨及肱骨，治療方法包括手術、化療、放療及綜合治療[1]。骨肉瘤患者的5年生存率較低，僅為63%[2]。微小RNA(miRNA)是一類非編碼小分子RNA，其長度約為22個核苷酸，調節超過30%的人體基因，參與細胞分化、增殖、凋亡及細胞周期調控等各種生物學過程[3～6]。miR-33a-5p屬于新發現的miR-33a家族成員，目前對其具體功能所知甚少。2015年1月～2016年1月，我們觀察了骨肉瘤細胞Saos-2中miR-33a-5p表達變化，現分析結果，探討其對細胞增殖的影響及相關機制。

1 材料與方法

1.1 材料 骨肉瘤細胞Saos-2及正常人成骨細胞hFOB1.19均購自南昌大學實驗醫學中心。實驗所需一抗均購自美國Santa Cruz公司，HRP標記的二抗均購自英國Abcam公司，MTT試劑盒和亞甲基藍均購自美國Sigma公司，miR-33a-5p mimics及Scramble均由上海吉馬制藥技術有限公司合成。

1.2 細胞miR-33a-5p mRNA相對表達量檢測 采用Real time-PCR法。取對數生長期的骨肉瘤細胞Saos-2及正常人成骨細胞hFOB1.19，采用TRIzol試劑提取總RNA。以總RNA為模板，使用M-MLV反轉錄酶在25 μL體系中對cDNA進行反轉錄。采用SYBR Green Ⅰ mix試劑盒于ABI VIIA7熒光定量PCR儀上進行檢測。miR-33a-5p上游引物：5′- GGTGCATTGTAGTTGCATTGC-3′，下游引物5′- GTGCAGGGTCCGAGGTATTC -3′。以GAPDH為內參，上游引物5′-GACTTCAACAGCAACTCCCAC-3′，下游引物5′-TCCACCACCCTGTTGCTGTA-3′。PCR反應條件：95 ℃預變性30 s，95 ℃變性5 s，60 ℃退火34 s，40個循環。以2-ΔΔCt法計算miR-33a-5p mRNA相對表達量。

1.3 細胞分組處理 將對數生長期的骨肉瘤細胞Saos-2分為mimics組及對照組，參照李振華等[7]的方法利用Lipofectamine 2000轉染試劑分別轉染miR-33a-5p mimics(可以增強細胞miR-33a-5p表達)及Scramble(把RNA序列打亂，對目的基因表達無影響)。將兩組加入DMEM培養基，置于37 ℃、5% CO2的飽和濕度恒溫細胞培養箱中進行培養，取對數生長期細胞用于以下實驗。

1.4 miR-33a-5p表達對骨肉瘤細胞Saos-2增殖的影響

1.4.1 細胞增殖能力 采用MTT法。取對數生長期的兩組細胞，以1×104個/孔接種于96孔板中，分別于培養24、48、72、96及120 h每孔加入40 μL的MTT溶液(5 mg/mL)。孵育4 h后每孔加入200 μL 二甲基亞砜(DMSO)，置于搖床上充分震蕩。采用酶標儀檢測兩組各時間點570 nm處的吸光度(OD)值，每組設置6個復孔，取平均值。

1.4.2 細胞克隆形成能力 采用細胞克隆形成實驗。取對數生長期的兩組細胞，以1×104個/孔接種于96孔板中，培養24 h時接種于12孔板中，每孔接種600個細胞。培養8 d去除培養液，用PBS沖洗3次，甲醇固定20 min；1%亞甲基藍染色40 min,去離子水清洗2次，晾干。40倍顯微鏡下計算>50個細胞的克隆數量，計算克隆形成率。克隆形成率=(克隆數/接種細胞數)×100%。每組設置3個復孔，實驗重復3次，取平均值。

1.4.3 細胞周期 采用流式細胞術。取對數生長期的兩組細胞，以1×104個/孔接種于96孔板中，培養24 h時PBS洗滌2次，70%乙醇固定，4 ℃保存過夜。PBS沖洗1次，將細胞密度調整為1×106個/mL。加入碘化丙啶染色液，至終濃度為0.05 mg/mL，4 ℃染色30 min。上流式細胞儀對兩組細胞周期進行分析。每組設置3個復孔，實驗重復3次，取平均值。

1.5 細胞周期相關蛋白相對表達量檢測 采用Westen blotting法。取對數生長期的兩組細胞，采用RIPA裂解液裂解，PMSF處理后冰上孵育30 min。4 ℃條件下12 000 r/min離心30 min，取上清蛋白。采用BCA蛋白濃度測定試劑盒檢測蛋白濃度，進行SDS-PAGE電泳，轉移至硝酸纖維素膜上。分別加入一抗anti-細胞周期蛋白激酶2(CDK2)、anti-CDK4、anti-細胞周期蛋白D(CyclinD)以及anti-Cyclin E(1∶2 000),加入anti-GAPDH、HRP標記的二抗(1∶2 000)，通過ECL法進行顯影。將膠片進行掃描或拍照，用凝膠圖像處理系統分析目標條帶的平均光密度值。以目的蛋白與GAPDH蛋白平均光密度值的比值計算細胞CDK2、CDK4以及CyclinD、CyclinE蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 骨肉瘤細胞Saos-2及正常人成骨細胞miR-33a-5p相對表達量比較 miR-33a-5p在骨肉瘤細胞Saos-2及正常人成骨細胞hFOB1.19中的相對表達量分別為2.65±0.43和24.32±3.21，兩者比較P<0.01。

2.2 兩組細胞增殖相關指標比較

2.2.1 細胞增殖能力 隨著培養時間的延長，兩組細胞增殖能力均呈升高趨勢；與對照組同時間點比較，mimics組細胞增殖能力均降低(P均<0.01)。見表1。

表1 兩組細胞增殖能力比較±s)

注：與對照組同時間點比較，*P<0.01。

2.2.2 細胞克隆形成能力 mimics組和對照組克隆形成率為25.34%±3.46%、53.27%±5.82%，兩組比較P<0.01。

2.2.3 細胞周期 mimics組和對照組分別有46.37%±4.28%、30.64%±3.52%的細胞處于G1期，分別有13.25%±1.25%、22.62%±2.01%的細胞處于G2期，兩組比較P均<0.01。

2.3 兩組細胞周期相關蛋白相對表達量比較 mimics組CDK2、CDK4、CyclinD、CyclinE蛋白相對表達量均低于對照組(P均<0.01)。見表2。

表2 兩組細胞周期相關蛋白相對表達量比較±s)

注：與對照組比較，*P<0.01。

3 討論

骨肉瘤主要累及骨髓腔及骨皮質，波及骨外膜時可形成特征性的三角形隆起，患者生存率較低[8]。近年來，一系列的醫學研究指出miRNA表達失調與多種腫瘤的發病相關，包括結腸癌、乳腺癌、骨肉瘤等[9～11]。Kobayashi等[3]通過7個骨肉瘤樣本的miRNA表達譜證實多個miRNA表達失調，包括miR-34、miR-140、miR-92a、miR-99b、miR-193a-5p等。miR-33a-5p屬于miR-33a家族成員，是近期發現的一種miRNA，目前對其具體生理功能所知甚少。文獻報道,miR-33a-5p參與調節T細胞功能[12]，并在肝癌細胞中參與調節β-catenin信號通路[13]。

miRNA mimics是一種化學方法人工合成的成熟miRNA片段,能模擬生物體內源性miRNAs[14]。通過轉染miRNA mimics能人為增加目標miRNA的表達，從而凸顯出目標miRNA的功能。miRNA Scramble是采用化學方法人工合成的隨機miRNA片段，無靶向性基因調控效應，多用作陰性對照。本研究結果顯示，miR-33a-5p在骨肉瘤細胞Saos-2中的相對表達量明顯低于正常人成骨細胞hFOB1.19，說明骨肉瘤的發病與miR-33a-5p表達降低有關。由于miR-33a-5p在骨肉瘤細胞內低表達，若采用常規基因沉默方法，將骨肉瘤細胞中miR-33a-5p表達進一步降低，則其表達變化幅度較小，難以體現其調控功能。因此本研究通過轉染miR-33a-5p mimics，人為增加miR-33a-5p表達，能顯著體現其對骨肉瘤細胞增殖的調控作用。本研究結果顯示，隨著培養時間的延長，兩組細胞增殖能力均呈升高趨勢；與對照組同時間點比較，mimics組細胞增殖能力均降低；mimics組克隆形成率也明顯低于對照組。證實miR-33a-5p對骨肉瘤細胞具有增殖抑制作用。細胞周期分為分裂間期和分裂期，分裂間期又分為G1期、S期及G2期。若細胞停留在G1期，則該細胞被稱為休止細胞或G0期細胞[15]。本研究結果表明，mimics組處于G1期的細胞比例明顯高于對照組，處于G2期的細胞比例明顯低于對照組。證實miR-33a-5p可誘導骨肉瘤細胞Saos-2停滯于G1期，從而抑制細胞增殖。

細胞周期蛋白(Cyclins)是一類對細胞周期進行調節的蛋白，其中CyclinD和CyclinE分別在G1期和S期進行表達，并對細胞分裂增殖起促進作用[16]。細胞周期蛋白激酶(CDKs)是一類調節細胞周期，具有促進細胞增殖作用的激酶[17]。CDK2與CDK4的功能在于促進細胞從G1期進入S期，進而促進細胞增殖。本研究結果顯示，mimics組CDK2、CDK4、CyclinD、CyclinE蛋白相對表達量均低于對照組，表明上述蛋白表達降低可能是miR-33a-5p抑制細胞增殖的機制之一。

綜上所述，骨肉瘤細胞Saos-2中miR-33a-5p表達降低，上調其表達后可抑制細胞增殖；下調CDK2、CDK4、CyclinD及CyclinE等細胞周期相關蛋白的表達可能為miR-33a-5p的作用機制。miR-33a-5p在體外實驗中表現出抑癌基因的功能，其作為一種新發現的miRNA，對抑制骨肉瘤細胞增殖具有重要作用，可能成為未來治療骨肉瘤新的作用靶點。

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Effect and mechanism of miR-33a-5p on the proliferation of osterosarcoma cells Saos-2

YUANZhong,HUJun,LEIJiawei,FULuheng,YUZengqiang,WANGHaiyan

(HongduHospitalAffiliatedtoJiangxiUniversityofTraditionalChineseMedicine,Nanchang330006,China)

Objective To investigate the effect and mechanism of miR-33a-5p on the proliferation of osteosarcoma cancer cells Saos-2. Methods RT-PCR was conducted to investigate the expression level of miR-33a-5p in Saos-2 cells and hFOB1.19 cells. Saos-2 cell line was divided into two groups, the mimics group was transfected with miR-33a-5p mimics and the control group was transfected with Scramble. The proliferation ability was analyzed by MTT cell viability assay at 24, 48, 72, 96 and 120 h of cultivation, the cloning ability was detected by clone-formation assay, the cell cycle was detected by flow cytometry, and the expression levels of CDK2, CDK4, CyclinD and CyclinE were measured by Western blotting. Results The expression levels of miR-33a-5p were 2.65±0.43 in the miR-33a-5p mimics group and 24.32±3.21 in the control group, respectively,P<0.01. The OD value of the two groups was increased as culturing. The OD value of mimics group was lower than that of the control group (allP<0.01). The clone-formation rate was 25.34%±3.46% in mimics group, which was significantly lower than that of the control group (53.27%±5.82%),P<0.01. There was 46.37%±4.28%% of the total mimics group of Saos-2 cells in the G1 phase, much higher than 30.64% ±3.52% in the control group; the percentage of G2phase in the mimics group was 13.25%±1.25%, which was much lower than 22.62%±2.01% in the control group (allP<0.01). The expression level of CDK2, CDK4, Cyclin D and Cyclin E in the mimics group was significantly lower than that of the control group (allP<0.01). Conclusion The miR-33a-5p expression was reduced, and up-regulation of miR-33a-5p may inhibit the proliferation of osterosarcoma cells Saos-2, whose mechanism may be down-regulating the cell cycles of CDK2, CDK4, Cyclin D and Cyclin E.

osteosarcoma; Saos-2 cells; miR-33a-5p; cell proliferation

袁忠(1969-)，男，副主任醫師，研究方向為骨腫瘤及骨質疏松。E-mail： yuanzhong122@sina.com

10.3969/j.issn.1002-266X.2016.32.002

R738.1

A

1002-266X(2016)32-0005-04

2016-02-27)