山東地區健康人群腺病毒稀有血清型感染狀況調查分析

周 奇，馬春玲，王國英

(1.青島大學醫學院，山東青島 266021;2.臨沂市婦女兒童醫院，山東臨沂 276002)

·論 著·

山東地區健康人群腺病毒稀有血清型感染狀況調查分析

周 奇1，2，馬春玲2，王國英1△

(1.青島大學醫學院，山東青島 266021;2.臨沂市婦女兒童醫院，山東臨沂 276002)

目的 調查山東地區健康人群中腺病毒不同血清型的感染狀況，篩選出流行水平較低的腺病毒血清型，用于腺病毒載體構建。方法 利用腺病毒不同血清型標準株，以ELISA方法檢測健康人群中不同腺病毒血清型的中和抗體。結果 山東地區18～70歲的健康人群中腺病毒總抗體的陽性率為95.2%。其中Adv3、Adv5、Adv7、Adv11、Adv26、Adv35、Adv48、Adv49中和抗體的陽性率分別為：69.8%、71.0%、61.0%、9.4%、2.2%、5.8%、0.8%、1.6%。Adv11、26、35、48、49 5個血清型的陽性率遠低于Adv3、5、7型(P<0.01)。結論 山東地區腺病毒的總感染率較高，不同血清型之間有顯著差異，其中Adv26、48、49型腺病毒感染率較低，可用于腺病毒載體的構建。

腺病毒; 載體; 血清型; 中和抗體; ELISA

腺病毒是1953年由Rowe等[1]從小兒扁桃體的細胞培養中發現的，對其生物學和免疫學特征人類已經有了比較全面的認識[2-3]。腺病毒自然感染非常普遍，部分血清型可引起爆發，但對免疫功能正常的人來說常自限性恢復，所以腺病毒的總體致病性相對較弱[4]。另外它可以感染很多分裂期或靜止期細胞，即使在一些高度分化的組織細胞中也可增殖。因此，修飾的腺病毒于上世紀80年代開始被用作哺乳動物細胞的轉基因載體。由于腺病毒載體具有宿主范圍廣、包裝容量大、轉染效率高、安全性好等突出的優勢，它已經成為繼逆轉錄病毒載體后被廣泛應用的載體系統[5]。目前使用的腺病毒載體多以5型腺病毒血清型的基因組為框架進行構建的，但是人群中普遍存在著5型腺病毒的中和抗體，研究證明中和抗體的存在是影響目的基因表達的一個重要因素，從而限制了腺病毒載體的廣泛應用[6]。對健康人群中不同腺病毒血清型的中和抗體進行檢測，統計分析不同血清型的中和抗體在人群中的存在情況，從中篩選出流行水平較低的稀有血清型，利用其基因組進行載體構建，可以減少現存中和抗體的免疫影響，有利于目的基因的表達。

1 資料與方法

1.1 一般資料 從山東省臨沂市、青島市、濟南市、菏澤市、威海市5個地區收集到健康體檢者的血清標本500例，均獲得知情同意。年齡為18～70歲，平均36歲，其中男242例，女258例。

1.2 主要毒株、細胞和試劑：腺病毒1～49型國際標準毒株購于北京302醫院病毒研究室；A549細胞購于中國科學院上海細胞生物學研究所；德國維潤腺病毒總抗體檢測試劑盒購于廣州市益滿生物科技有限公司。

1.3 血清標本的收集與制備 每個研究對象均采集空腹靜脈血5 mL，血液標本常溫放置30 min后，3 000 r/min離心10 min，收集血清1.5 mL轉移至EP管中,置于-20 ℃備用。

1.4 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型病毒的擴增、提純與滴度測定 首先對凍存的A549細胞進行復蘇并傳代；取上述血清型的腺病毒感染A549細胞進行病毒擴增；擴增后通過氯化銫梯度離心法進行純化；最后以Karber法計算病毒滴度。

1.5 血清腺病毒總抗體的檢測 利用德國維潤腺病毒IgG抗體檢測試劑盒，嚴格按照試劑說明書進行操作，對500例正常血清進行原倍檢測，從中篩選出腺病毒感染陽性的血清標本。

1.6 血清中和抗體效價的測定 A549細胞以5×103個細胞/孔加入96孔板中，37℃，5%CO2培養，抽取隨機血清標本20份，用PBS等比稀釋，與同體積MOI=20的各血清型病毒原液混合后加入96孔板中，設細胞、病毒對照，培養3 d后觀察細胞生長狀態，在病毒對照出現70%以上的病變時判斷結果，以完全抑制細胞病變的最大稀釋倍數做為中和抗體的效價。

1.7 用ELISA方法檢測血清中Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒的中和抗體的陽性率 用包被緩沖液將各病毒原液稀釋至2×106pfu/mL加入到96微孔板中，每孔加100 μL，4 ℃過夜。次日洗滌3次。加一定稀釋的待檢血清、陰性血清、陽性對照100 μL于上述已包被之反應孔中，置37 ℃孵育1 h，洗滌，加入新鮮稀釋的酶標二抗100 μL，37 ℃孵育1 h，洗滌，加入底物100 μL，37 ℃孵育30 min，加入終止液50 μL，用酶標儀讀取試驗結果。

1.8 陽性結果判斷 使用陰性血清測定結果均值的2倍作為陽性判斷值。

1.9 統計學處理 應用SPSS19.0軟件進行統計學分析和數據處理，以P<0.05作為差異具有統計學意義的標準。

2 結 果

2.1 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒擴增的結果 加入各型腺病毒原液50 μL感染A549細胞，3 d以后細胞開始出現病變，與正常細胞對照組相比典型的CPE為：細胞腫脹、變圓、脫落。分別選取一個正常細胞對照和一個典型CPE進行拍照，結果見圖1。

A表示未感染腺病毒Ad35的A549細胞;B表示感染腺病毒Ad35的A549細胞。

圖1 A549細胞的形態

2.2 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒滴度的檢測結果 通過系列倍比稀釋的病毒液感染96孔板中的A549細胞，10 d后計數CPE出現的孔數，按公式Titre(pfu/mL)=10(x+0.8)測得病毒滴度分別為:Ad3=1.2×109pfu/mL,Ad5=1.9×109pfu/mL,Ad7=1.1×109pfu/mL,Ad11=1.5×109pfu/mL,Ad26=2.0×109pfu/mL,Ad35=0.6×109pfu/mL,Ad48=2.2×109pfu/mL,Ad49=1.8×109pfu/mL。

2.3 血清腺病毒總抗體陽性率 對500例血清進行總抗體檢測，只有24例標本為陰性，陽性率為95.2%，對陽性血清再進行中和抗體的檢測，見圖2。

2.4 血清中和抗體效價的檢測 血清中和抗體效價試驗結果見表1，隨機抽選的20例血清標本中，Ad35、48、49均沒有檢測到相應的中和抗體，Ad3的效價在1∶8稀釋倍數后有所下降，其他血清型的中和抗體效價均在1∶4的稀釋倍數后開始有所下降，因此選擇1∶4作為血清的稀釋倍數，見表1。

2.5 Ad3、Ad5、Ad7、Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49各型腺病毒中和抗體的ELISA檢測結果 從以上結果可以看出Ad3、Ad5、Ad7血清型陽性率均在60%以上，其余5個型別的腺病毒的流行水平較低，均低于10%。其中Ad11型陽性率最高為9.40%，其次是Ad35型陽性率5.8%，Ad26型陽性率2.2%，Ad49型陽性率1.6%，Ad48型陽性率最低為0.8%。Ad3、Ad5、Ad7血清型的陽性率與Ad11、Ad26、Ad35、Ad48、Ad49血清型比較，差異有統計學意義(P<0.01)，見表2。

表1 各型腺病毒的中和抗體的效價

表2 各型腺病毒的中和抗體的陽性率

圖2 各型腺病毒中和抗體陽性率比較

3 討 論

至20世紀80年代腺病毒基因組用于載體的構建以來，腺病毒載體在基因診斷和疫苗應用上得到了廣泛應用[5]，但是腺病毒載體還存在著缺乏靶向性、目的基因表達持續時間較短、外源基因表達的可控性差等問題，對腺病毒載體進行優化是研究者們研究的熱點。

目的基因表達持續時間普遍認為與機體的免疫反應有關。國外有研究小組將表達熒光素酶包被基因重組的Ad35型腺病毒載體注射到有5-型腺病毒型免疫力小鼠體內[6]，明顯地檢測到熒光素酶的表達；而用熒光素酶包被基因重組的5-型腺病毒型載體感染同樣有5-型腺病毒型免疫力小鼠，此包被基因的表達活性較沒有5-型腺病毒型免疫力的對照小鼠下降90%。這說明避開現存的腺病毒中和抗體的影響可提高目的基因的表達活性。

腺病毒各血清型的分布存在一定地區和人種的差異，對山東地區健康人群進行腺病毒各血清型中和抗體的檢測，有利于了解山東地區健康人群中腺病毒中和抗體的存在情況，對避開現存中和抗體構建新型腺病毒載體打下研究基礎[7-9]。

本研究證明在我國山東地區的健康人群中，腺病毒不同血清型中和抗體的陽性率有著顯著差異，其中Ad5的中和抗體陽性率最高，對5型腺病毒載體的臨床應用會造成一定影響。Ad11、Ad35、Ad26、Ad49、Ad48型的中和抗體陽性率較低，均在10%以下。利用陽性率最低的Ad26、Ad49、Ad48三型腺病毒構建載體相對于Ad5型來說可有效避開健康人群中腺病毒現存免疫力的影響，有利于目的基因的表達。

[1]RoweWP,HuebnerRJ,GilmoreLK,etal.Isolation

of a cytopathic agent from human adenoids undergoing spontaneous degeneration in tissue culture[J].Soc Bio Med,1953,84(3):570-573.

[2]Smith JG,Wiethoff CM,Stewart PL,et al.Adenovirus[J].Curr Top Microbiol Immunol,2010,343(2):195-224.

[3] 陳娜娜,向冬喜,鄭叢龍.腺病毒及其研究進展[J].大連醫科大學學報,2010,32(5):586-590.

[4]謝立,楊旭輝,陳恩富.腺病毒感染研究進展[J].浙江預防醫學,2015,27(3):262-265.

[5]祝秀梅,慕洪濤,王凡,等.腺病毒載體研究進展與展望[J].湖北農業科學，2010,49(1):218-221.

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Investigation and analysis on infection situation of rare adenovirus serotype among normal population in Shandong area

ZhouQi1,2,MaChunling2,WangGuoying1△

(1.MedicalCollege,QingdaoUniversity,Qingdao,Shandong266021,China;2.LinyiMunicipalWomenandChildren′sHospital,Linyi,Shandong276002,China)

Objective To investigate the infection status of different adenovirus serotypes of adenovirus among normal population in Shandong area in order to screen out the serotypes of low prevalence level for the use in the adenoviral vector construction.Methods Serum levels of neutralizing antibodies against different serotypes of adenovirus were determined with ELISA by using different adenovirus serotype standard strains.Results The positive rate of total adenovirus antibodies in the normal population aged 18-70 years old in Shandong area was 95.2%,in which the antibody positive rates of Adv3,Adv5,Adv7,Adv11,Adv26,Adv35,Adv48 and Adv49 were 69.8%,71.0%,61.0%,9.4%,2.2%,5.8%,0.8% and 1.6%,respectively.The positive rates of Adv11,26,35,48,49 neutralizing antibodies were significantly lower than those of Adv3,5,7 serotypes(P<0.01).Conclusion The adenovirus total infection rate is high in Shandong area.The infection rates of different serotypes are different,in which Adv26,48,49 serotypes have lower infection rates and can be used for constructing the adenovirus vector.

adenovirus; vector; serotype; neutralizing antibodies; ELISA

周奇，男，主管檢驗技師，主要從事病毒免疫學研究?！魍ㄓ嵶髡?，E-mail:bbq999@163.com。

10.3969/j.issn.1673-4130.2016.07.021 文獻標識碼：A 文章編號：1673-4130(2016)07-0923-03

2015-10-20)