兩種植物精油對白紋伊蚊的熏殺及酯酶活性的影響*＊?

周長榮，溫小軍，劉　磊

(貴州醫科大學基礎醫學院生物學教研室，貴州貴陽　550025)

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兩種植物精油對白紋伊蚊的熏殺及酯酶活性的影響*＊?

周長榮，溫小軍＊＊，劉磊

(貴州醫科大學基礎醫學院生物學教研室，貴州貴陽550025)

［摘要］目的:測定珊瑚姜精油和樟樹葉精油對白紋伊蚊雌性成蚊的熏殺活性及熏殺蚊蟲的作用機理。方法:用水蒸汽蒸餾法提取珊瑚姜塊莖精油和樟樹鮮葉精油，三角瓶法測定兩種精油對白紋伊蚊雌性成蚊的熏殺活性，微板法檢測兩種精油對白紋伊蚊乙酰膽堿酯酶(AChE)和非特異性酯酶(NSE)活性的影響。結果:珊瑚姜精油和樟樹葉精油對白紋伊蚊24 h熏蒸LC(50)分別是80.208 μg/cm3、20.709 μg/cm3;在78.696 μg/cm3和31.976 μg/cm3劑量下，珊瑚姜精油和樟樹葉精油對白紋伊蚊的KT(50)分別為35.759 min和6.341 min;兩種植物精油對白紋伊蚊AChE均有抑制作用，酶活性抑制率分別為29.97%和4.03%;兩種精油對白紋伊蚊的NSE有促進作用，酶活性增長率分別為21.55%和18.62%。結論:樟樹葉精油更適宜作為植物源滅蚊產品的基礎材料。

［關鍵詞］伊蚊屬;植物精油類;熏殺活性;乙酰膽堿酯酶;非特異性酯酶

＊＊通信作者E-mail: 2547285543@ qq.com

網絡出版時間: 2016－02－23網絡出版地址: http: / /www.cnki.net/kcms/detail/52.5012.R.20160223.1959.024.html

白紋伊蚊(Aedes albopictus)是我國南方最常見的吸血蚊蟲，是登革熱、乙型腦炎等疾病的傳播媒介，屬于ISSG (invasive species specialist group)列出的全球100種惡性擴散的物種之一［1］。白紋伊蚊也是我國評定農藥殺蟲劑的指定試蟲(GB/T 17322.10—1998)［2］，一直是我國公共衛生防治的主要對象。防治蚊蟲時通常使用化學殺蟲劑，但長期使用會導致嚴重的“3R”問題［3］。與傳統的化學殺蟲劑相比，植物精油具有對人類安全、環保和蚊蟲不易產生抗性等優點，并且大量的研究證明植物精油對害蟲有熏殺活性，可作為蚊蟲防制的有效措施之一［4－7］。乙酰膽堿酯酶(acetylcholinesterase，AChE)是生物神經傳導中的一種關鍵酶，其活性的變化是殺蟲劑毒理與抗性研究的重要指標［8］。非特異性酯酶(non-specific esterase，NSE)普遍存在于昆蟲體內各種組織中，能夠催化水解神經毒，NSE的含量和活性變化也是殺蟲劑抗性及毒理研究的重要依據［9－10］。本研究通過檢測珊瑚姜和樟樹兩種植物精油對白紋伊蚊成蚊的熏殺活性，并測試其對白紋伊蚊體內AChE和NSE活性的影響，為篩選和研制環保、高效的植物源滅蚊產品提供科學依據。

1　材料與方法

1.1供試精油

珊瑚姜(Zingiber corallinum Hance)干燥塊莖購自貴鋼花鳥市場，樟樹［Cinnamomum camphora (L.)］鮮葉采自貴州醫科大學校園，經貴州醫科大學藥學院龍慶德教授鑒定。塊莖過40目篩，鮮葉剪成1 cm×2 cm碎片。精油通過水蒸汽蒸餾法提取:將150 g的植物材料置于2 000 mL的圓底燒瓶中，加入1 500 mL的蒸餾水，過夜浸泡;加熱蒸餾6 h。珊瑚姜精油和樟樹葉精油的提取率(油/鮮重)和密度分別為5.2%和0.905 g/mL、1.1%和0.919 g/ mL。精油收集于棕色試劑瓶內，經無水硫酸鈉干燥后，保存于4℃冰箱中備用。

1.2供試蚊蟲

實驗用蟲為貴州醫科大學生物學教研室蚊房訓養的白紋伊蚊Aedes albopictus雌性成蚊。馴養溫度(26±2)℃，濕度(65±5) %，光照周期14 L∶10 D。

1.3主要試劑和主要儀器

主要試劑有5，5-二硫雙硝基苯甲酸(DTNB)，碘化硫代乙酰膽堿(ATChI)，異丙醇，乙酸-2-萘酯(β-NA)，堅固藍B鹽。主要儀器有Bioteck Epoch型酶標儀，TGL16M型臺式高速冷凍離心機。

1.4熏殺活性測定

按照參考文獻［10］三角瓶熏蒸法改進后，在溫度(26±2)℃、濕度(65±5) %條件下進行兩種植物精油對白紋伊蚊的熏殺活性測定:用吸蚊管吸取30頭羽化后2～3 d未吸血的的成蚊放入250 mL三角瓶內(實測容積為345 mL)并以白紗布封口。在白紗布上開1.5 cm寬的小口，在濾紙條(10 cm×1 cm)下端1～2 cm處分別滴加5組不同劑量的精油，使之成等差分布。珊瑚姜精油和樟樹葉精油熏蒸白紋伊蚊的劑量分別是26.232、52.464、78.696、104.928及131.160 μg/cm3和10.659、21.317、31.976、42.634及53.293 μg/ cm3。待精油滲透濾紙后將濾紙條從紗布開口處深入三角瓶內，一端固定于三角瓶口，迅速用保鮮膜封口并開始計時，每2 min記錄一次被擊倒的試蟲數，待蚊蟲全部被擊倒后，將全部試蟲移入潔凈的1 000 mL燒杯中，用白紗布封口，用10%的葡萄糖水飼養24 h后，觀察并記錄試蟲死亡數。每個處理組重復3次，同時設空白對照組，死亡率取3次重復的平均值。

1.5酶源制備

參照參考文獻［11］取羽化后1～5 d尚未吸血的雌蚊30只，精油的熏殺LC95劑量(珊瑚姜和樟樹葉的LC95值分別是130.496和51.739 μg/cm3)，用1.4項下方法處理成蚊，實驗設3個處理組和1個對照組;待蚊蟲翻倒后取出，用流動蒸餾水沖洗并用濾紙吸干水分;將處理后的單只蚊蟲放入1.5 mL的離心管中并加入100 μL預冷的磷酸緩沖液(AChE pH7.2，NSE pH 6.8)，冰浴研磨混勻，4℃、15 000 r/min離心10 min，取上清液加入900 μL預冷的磷酸緩沖液稀釋，備用。

1.6 AChE活性測定

參照張云等［12］的方法并加以改進，將100 μL蚊蟲勻漿液加入到96孔酶標板中，每孔加入ATChI液100 μL (ATChI 75 mg溶于pH 7.2的磷酸緩沖液100 mL)，30℃條件下水浴30 min，每孔加入DTNB液100 μL(DTNB 13 mg溶于pH 7.2的磷酸緩沖液100 mL)以終止反應，5 min后，在酶標儀410 nm波長下讀取OD值，計算酶活性增長率公式:酶活性增長率(%) = (處理組OD值－對照組OD值) /對照組OD值×100%。

1.7 NSE活性的測定

按張云等［12］文獻的方法進行調整:先將100 μL蚊蟲勻漿液加入96孔酶標板中，每孔加入β-NA溶液100 mL(β-NA 56 mg依次溶于pH 6.8磷酸緩沖液10 mL和90 mL)，25℃條件下水浴10 min，每孔再加堅固藍B鹽溶液100 μL(堅固藍B鹽100 mg溶于100 mL蒸餾水)，反應5 min后置于酶標儀上490 nm波長下讀取OD值。按照1.6項下公式計算NSE活性。

1.8統計學處理

用SPSS 17.0統計軟件通過概率值分析法分別計算出兩種植物精油熏殺蚊蟲的KT50值、LC50值、LC95值、95%置信區間和毒力回歸方程。AChE 和NSE的活性以OD值表示，兩種精油處理比較用t檢驗，兩種植物精油對白紋伊蚊AChE和非特異性酯酶活性的影響以酶活性增長率表示，酶活性增長率為為負值表示精油對該酶具有抑制作用，為正值表示精油對該酶具有促進作用。

2　結果

2.1兩種植物精油對白紋伊蚊的熏殺活性

用珊瑚姜和樟樹葉精油處理白紋伊蚊成蚊后，發現成蚊飛行速度加快，之后開始沿著三角瓶壁掙扎，行動緩慢，翻倒又爬起數次后最終被擊倒，提示珊瑚姜精油和樟樹葉精油對白紋伊蚊有熏殺活性，對白紋伊蚊的24 h熏蒸LC50依次為80.208、24.709 μg/ cm3，即24 h樟樹葉精油對蚊蟲的LC50值小于珊瑚姜精油。隨著精油濃度的增加，白紋伊蚊被擊倒速度明顯加快，24 h死亡率也逐漸增加，對蚊蟲的熏殺效果增強，樟樹葉對白紋伊蚊的KT50(6.341 min)所需要的時間比珊瑚姜(35.759 min)的少。空白對照組蚊蟲無死亡。見表1、2。

表1　兩種植物精油對白紋伊蚊成蚊24 h毒殺活性Tab.1　Insecticidal activity of two essential oils against adult of Aedes albopictus at 24 hours

表2　不同濃度兩種植物精油對白紋伊蚊24 h熏蒸效果Tab.2　Fumigation effect of two essential oils against adult of Aedes albopictus at different concentrations in 24 hours

2.2兩種植物精油對白紋伊蚊的酯酶活性的影響

分別以2種植物精油的LC95劑量熏蒸白紋伊蚊后，蚊體內的AChE表現為抑制作用，酶活性抑制率分別為29.97%和4.03%;兩種精油對白紋伊蚊的NSE均表現出明顯的誘導作用，酶活性增長率分別為21.55%和18.62%;珊瑚姜精油對白紋伊蚊的AChE的抑制作用和NSE的誘導作用比樟樹葉精油強。

3　討論

本研究中，熏殺實驗開始前，蚊蟲基本上停在三角瓶底部，加入植物精油后蚊蟲表現十分活躍，并且持續不規則旋轉飛動，反復飛起和滑落，最終仰面倒在瓶底，肢體抽搐。這種現象和楊頻等［13］報道的蚊蟲神經系統中毒熏殺現象相似，說明白紋伊蚊經兩種精油處理后，表現為神經系統中毒。兩種植物精油對白紋伊蚊成蚊都具有熏殺作用，其中樟樹葉對白紋伊蚊的熏殺活性更強(LC50值為24.709 μg/mL)，其效果優于嶺南花椒(LC5047.14 μg/ mL)［14］、竹葉花椒(LC5029.52 μg/mL)［15］、遼細辛(LC5069.35 μg/mL)［16］等植物的精油。

本研究中，經兩種植物精油處理后，白紋伊蚊體內的AChE與NSE活性都表現出明顯變化，這與楊頻［17］等的報道相符，表明兩種植物精油的作用靶標是AChE和NSE。乙酰膽堿(ACh)在中樞神經系統內由中樞膽堿能神經末梢釋放，是中樞神經重要的遞質之一。AChE是ACh的水解酶，能將ACh水解為膽堿和乙酸，終止神經沖動。伍一軍等［18］的報道表明，當AChE活性被抑制時，Ach不能被及時分解，從而在突觸間隙內堆積，導致信號傳遞被阻斷，昆蟲出現運動障礙、呼吸麻痹等中毒癥狀，最終死亡。白紋伊蚊分別經兩種精油處理后，體內的AChE活性被抑制，Ach不能被及時分解導致信號傳遞被阻斷，故蚊蟲表現出不規則的旋轉運動。NSE是蚊蟲體內主要的解毒酶，能夠催化水解神經毒素，其活性升高，則說明蚊蟲的解毒作用和對神經毒素的耐受性增強。Silvia等［19］指出，殺蟲劑可抑制昆蟲體內的NSE活性，這樣會導致昆蟲的解毒能力及對藥物的耐受性下降。蚊蟲體內的解毒酶NSE對珊瑚姜精油和樟樹葉精油的活性有一定影響。白紋伊蚊經過兩種植物精油處理后NSE活性增強，說明白紋伊蚊對兩種精油的解毒作用很強，能夠迅速降解進入體內的精油活性成分，但是經珊瑚姜精油處理過的白紋伊蚊NSE比經樟樹葉處理過的強，說明珊瑚姜精油的解毒酶活性比較強，能夠迅速降解進入體內的精油活性成分，所以需要更高濃度的精油才能發揮殺蟲作用，這與熏殺結果中熏殺白紋伊蚊所需要的珊瑚姜濃度比樟樹葉高相吻合。白紋伊蚊經兩種精油處理后體內AChE和NSE活性的影響程度不同的原因可能是兩種精油中化合物的種類及含量和LC95劑量不同。植物精油組分與蚊蟲體內AChE和NSE活性變化仍需進一步研究。

綜上所述，通過兩種植物精油對白紋伊蚊的熏殺活性、24 h死亡率及對蚊體內AChE和NSE活性的影響的比較，樟樹葉對白紋伊蚊的LC95值較低，熏殺活性較強，，并且對蚊蟲體內AChE的誘導作用較弱，NSE的抑制作用較強。因此樟樹葉精油更適宜作為植物源滅蚊產品的基礎材料。

圖1　兩種植物精油的LC95劑量對白紋伊蚊AChE和NSE活性的影響Fig.1　Effects of the two essential oils on activity of AChE and NSE of Aedes albopictus at LC95concentration

4　參考文獻

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(2015－12－15收稿，2016－01－20修回)

中文編輯:吳昌學;英文編輯:趙毅

Effect of Two Plant Essential Oils on Fumigating Insecticidal Activities of Aedes Albopictus and Esterase Activity

ZHOU Changrong，WEN Xiaojun，LIU Lei
(Department of Biology，Guizhou Medical University，Guiyang 550025，Guizhou，China)

［Abstract］Objective: To investigate the fumigating insecticidal activities of essential oils extracted from Zingiber corallinum Hance and fresh leaves of Cinnamomum camphora (L.) against the female adult mosquitoes of Aedes albopictus and the fumigant mechanism.Methods: Essential oils were extracted from roots of Zingber corallinum Hance and fresh leaves of Cinnamomum camphora by steam distillation.The fumigating activities of these essential oils against Aedes albopictus were measured by erlenmeyer flask method.The activation changes of acetylcholinesterase (AchE) and non-specific esterase (NSE) of the female adults mosquitoes of Aedes albopictus fumigant treated with two essential oils were measured by the microplate assay.Results: The LC(50)values of Zingber corallinum Hance and Cinnamomum camphora against Aedes albopictus at 24 h were 80.208 μg/cm3、20.709 μg/cm3respectively.The KT50 values of Zingiber corallinum Hance and fresh leaves of Cinnamomum camphora (L.) against the female adults mosquitoes of Aedes albopictus at fumigating concentration 78.696 and 31.976 μg/cm3were 35.759 and 6.341 min respectively.The acetylcholinesterase of Aedes albopictus which was treated by Zingiber corallinum Hance and fresh leaves of Cinnamomum camphora (L.) was inhibited.The reduced rates were 29.97% and 4.03%.The esterase activity increased rates were 21.55% and 18.62%.Conclusion: The results indicate that extracted oil from Cinnamomum camphora (L.) is effective potential mosquitocide.

［Key words］Aedes albopictus; plant essential oils; fumigating insecticidal activity; acetylcholinesterase; non-speci esterase

*［基金項目］貴州省科技廳與貴州醫科大學聯合基金［黔科合LG字(2012) 15號］

［中圖分類號］Q949.32

［文獻標識碼］A

［文章編號］1000-2707(2016) 02-0162-04