烏司他丁對控制性降壓誘導的缺血缺氧腦損傷Caspase—3表達及凋亡程度

張超城 肖曉山

【摘要】 目的：觀察烏司他丁對控制性降壓誘導的缺血缺氧腦損傷Caspase-3表達及凋亡程度。方法：60只新西蘭大白兔隨機分成5組，每組12只：正常組（Ⅰ組），控制性降壓組（Ⅱ組，平均動脈壓降至基礎值的45%組），烏司他丁降壓前給藥組（Ⅲ組，控制性降壓前30min靜注烏司他丁10*104IU/kg），烏司他丁降壓后給藥組（Ⅳ組，控制性降壓開始后30min靜注烏司他丁10*104IU/kg），烏司他丁降壓前+降壓后給藥組（Ⅴ組，控制性降壓開始前30min和開始后30min均靜注烏司他丁10*104IU/kg）。各組在硝普鈉降壓一個小時后，停止降壓2小時后處死，取出海馬組織。TUNEL檢測海馬凋亡細胞，用Western-blot檢測海馬組織casspase-3。結果：1、Western-blot檢測：與II組比較，三組用藥組（III、IV、V組）Caspase-3表達顯著減少（P<0.01）；與III、IV組比較， V組Caspase-3表達減少（P<0.05）。與II組比較，用藥三組調亡指數減少（P<0.01）。2、TUNEL檢測：與II組、III組、IV組、V組比較，顯示I組調亡指數最少的（P<0.01）。與III組、V組比較，顯示IV組的調亡指數有所增加（P<0.05）。結論：1、烏司他丁對控制性降壓引起腦缺血缺氧腦損傷是有保護作用，其可能抑制Caspase-3的表達，減少神經細胞凋亡有關；2、在三組給藥的不同時段比較中，降壓前+降壓后給藥組（V組）Caspase-3的表達最少；由此說明，推薦的給藥方法是降壓前和降壓后同時給藥。

【關鍵詞】烏司他丁；控制性降壓； 缺血缺氧腦損傷； casspase-3

【中圖分類號】R4 【文獻標識碼】A 【文章編號】1671-8801（2016）02-0014-02

控制性降壓是在手術中常用的技術。同時控制性降壓也會帶來風險，有學者報導在控制性降壓出現腦損傷等[1-2]。關于不同的控制性降壓水平對兔海馬CA1神經元影響的研究[3]結果顯示MAP降至基礎值的45%，兔海馬CA1神經元凋亡程度最嚴重，因此本研究以MAP降至基礎值45%，以觀察烏司他丁對控制性降壓誘導的缺血缺氧腦損傷Caspase-3表達及凋亡程度以指導臨床應用。

1 資料與方法

1.1 實驗材料

實驗動物 清潔級新西蘭雄性大白兔，體重1.8-2.2kg。

實驗藥物及試劑 烏司他丁、TUNEL試劑盒、Caspase-3。

1.2 實驗方法

分組及給藥方法 健康新西蘭白兔60只，雄性，體重1.8-2.2Kg，由南方醫科大學實驗動物中心提供。60只健康新西蘭白兔，隨機分成5組，每組12只：正常組（I組），控制性降壓組（II組，平均動脈壓[MAP]降至基礎值的45%組），烏司他丁降壓前用藥組（III組，控制性降壓前30min靜脈注射烏司他丁10*104U/kg），烏司他丁降壓后用藥組（IV組，控制性降壓開始后30min靜脈注射烏司他丁10*104U/kg），烏司他丁降壓前+降壓后用藥組（V組，控制性降壓開始前30min和開始后30min均給予靜脈注射烏司他丁10*104U/kg）。

動物模型 氯胺酮50 mg/kg復合1mg/kg力月西肌注麻醉（術中肌注氯胺酮20 mg/kg/30min）。沿頸中正切開，分離氣管，插入氣管導管，接呼吸機機械通氣（潮氣量21ml，呼吸51bpm，FiO21.0）。分離頸內靜脈、穿刺置管，接延長管輸液通路并輸液（8ml/kg）。在兔腹股溝下緣分離股動脈并穿刺置管，接測壓轉換器并開始動脈測壓。正常組采用5%葡萄糖注射液4ml/ （kg*h） 連續泵注；降壓組及治療組均采用5%葡萄糖液配制的硝普鈉（400ug/ml）開始泵注，10-15分鐘內降至目標血壓，維持目標血壓l h。根據上述分組方案，給予烏司他丁。降壓完畢后，實驗動物復壓2 h后處死。

1.3 標本采集與處理 每組動物中的一半用于灌注固定：降壓停止后2h，打開胸腔暴露心臟，由心尖進針插入升主動脈（同時鉗夾腹主動脈，剪開右心耳），快速滴注37℃生理鹽水500ml，無血污后改為滴注4%多聚甲醛固定液500mL，先在5min內灌入約100ml，余液在25分鐘內灌完。開顱取出1mm及4mm海馬組織，切取右邊1mm3置于4%多聚甲醛液中后固定，剩余組織放置于中性甲醛溶液中固定、梯度乙醇脫水、包埋、切片、撈片、烤片。每組中另外一半動物在復壓2h后處死，迅速取出海馬組織，在-80℃凍存，用于Western Blot檢測。

1.4 標本檢測方法

1.4.1 Western-blot檢測Caspase-3的表達

剪碎組織，與裂解液1：5混合，取上均漿。離心，取上清液；使用Bradford法進行蛋白質定量，然后12%SDS-PAGE電泳分離，依marker指示，將測蛋白轉PVDF膜上；封閉液4℃過夜，抗Caspase-3抗體1：1500稀釋與PVDF膜溫2H，加入二抗，ECL反應2min，將蛋白印跡曝光在X光膠片上。結果使用Gel-Pro Analyzet4.0進行分析。以GAPDH為內參。

1.4.2 TUNEL檢測凋亡細胞

將冰凍組織切片固定10min，PBS 漂洗10*2min。再置乙醇：乙酸（2：1）溶液-20℃處理5min。PBS 漂洗10*2min。2% H2O2浸泡5min。PBS洗滌10*2min。滴加TdT酶反應液，37℃孵育1h（陰性染色對照，加不含TdT酶的緩沖液替代）。滴加兩滴過氧化物酶標記的地高辛抗體，室溫孵育30min。PBS洗滌10*2min。DAB顯色3～6min。蒸餾水洗5*3min。甲基綠復染10min。蒸餾水洗5*3min，再用100%正丁醇5*3min。常規脫水、透明和封片。在400倍光鏡下觀察海馬組織病理學改變。隨機選取6個視野，按照（TUNEL陽性神經細胞/神經細胞總數）×100%計算海馬神經細胞的凋亡指數。

1.5 統計學處理

各組數據應用SPSS13.0進行分析。所有計量資料進行方差齊性檢驗，組間比較采用單因素方差分析，P<0.05，認為有差異統計學意義。

2 結果

2.1 Western-blot檢測Caspase-3的表達

與控制性降壓組（II組）比較，三組用藥組（III、IV、V組）Caspase-3含量顯著減少（P<0.01）；V組與III、IV比較，顯示V組Caspase-3含量減少（P<0.05）。結果如下圖：

2.2 TUNEL檢測凋亡細胞

與II組比較，III、IV、V組三組調亡指數減少（P<0.01）。II、III、IV、V組與I組比較，P<0.01，顯示正常組調亡指數最少的。IV組與III、V組比較，P<0.05，顯示IV組，調亡指數有所增加。

3 討論

腦血流有自動調節功能，但是這種自我調控功能和耐受性的平均動脈壓的安全低限存在明顯的個體差異。同時腦的生理特性也是腦缺血缺氧易損傷的原因之一。當控制性降壓引腦灌注壓明顯下降時，極易使腦缺血缺氧而受到損害[4-5]。

腦缺血缺氧會引起促進細胞凋亡[6]。參與凋亡過程相關的基因有幾十種，其研究較多的如Bcl-2家族[7]、即早基因[8]、caspase家族[9]等。其中，Caspase-3是細胞凋亡過程中最主要的終末剪切酶，也是CTL細胞殺傷機制的重要組成部分。在凋亡級聯反應中，Caspase-3是最為主要的，在神經元細胞凋亡過程中起著決定性作用[10]。

本實驗中，Western blot檢測Caspase-3顯示給藥三組（III組、IV組及V組）與控制性降壓組比較，三組用藥組Caspase-3的含量顯著減少，說明用藥后，Caspase-3的表達是減少的，減輕了神經細胞凋亡反應。烏司他丁降壓前+降壓后用藥組Caspase-3的表達，明顯少量其它用藥二組，說明V組烏司他丁的用藥方法更好的抑制Caspase-3的表達，減輕了神經細胞凋亡。同時在凋亡指數中正常組的神經海馬細胞的凋亡指數是最少的，而控制性降壓組的凋亡指數是最嚴重的。同時，與控制性降壓組比較，用藥三組凋亡指數降壓，說明烏司他丁有效減輕控制性降壓引起的腦缺血缺氧腦損傷的細胞凋亡。而用藥三組之間比較顯示，降壓后給藥組細胞凋亡更嚴重。說明在用藥三組比較，降壓后給藥，神經細胞凋亡比較多。

綜上所述，烏司他丁對控制性降壓引起腦缺血缺氧腦損傷是有保護作用，其可能抑制Caspase-3的表達，減少神經細胞凋亡有關；在三組給藥的不同時段比較中，降壓前+降壓后給藥組Caspase-3的表達最少；由此說明，推薦的給藥方法是降壓前和降壓后同時給藥。

參考文獻：

[1] Mcleod ME，Creighton RE，Humphreys RP.Anaesthetic management of arteriovenous malfol'inations of the vein of Galen.Can Anaesth Soc J，1 982，29（4）：307-3 12.

[2] Pasch T，Huk W.Cerebral complications following induced hypotension.Eur J Anaesthesiol，1 986，3（4）：299-3 12.

[3] Liu B， Zhou D， Huang H， Xiao X. Experimental study on the effect of controlled hypotension levels on rabbit CA1 neurons. J Sur Res， 2013， 182（1）：e15-24.

[4] Jones TH，Chiappa KH，Young RR，et al.EEG monitoring for induced hypotension for surgery of intracranial aneurysms.Stroke，1979，10（3）：292-294.

[5] Pasch T， Huk W.cerebral complications following induced hypotension. Eur J Anaesthesiol，1986，3（4）：299-32.

[6] 石義亭，趙毅，張新東等.腦出血灶周圍組織Bax、Bcl一2的表達與神經元凋亡關系的實驗研究[J].中國實用神經疾病雜志，2006，9（2）：4—5.

[7] Linnik M D，Zahos P，Geschwind M D，et al. Expression of bcl-2 from a defective herpes simples virus-1 vector limits neuronal death in focal cerebral ischemia[J].stroke 1995，26（9）：1670-1675.

[8] Jang M H，Shin M C，Lee T H，et al. Acupuncture suppresses ischemia-induced increase in c-Fos expression and apoptosis in the hippocampal CA1 region in gerbils[J].Neurosci Lett，2003，347（1）：5-8.

[9] Shimizu H， Ohgoh M，Ikeda M，et al. Caspase-3-like protease activity-independent apoptosis at the onset of neuronal cell death in the gerbil hippocampus after global ischemia[J].Biol Pharm Bull，2007，30（10）：1950-1953.

[10]YU D，MAO M.ZHOU H，et a1.Pathological changes and apoptosis of brain cells in rat embryo suffering from intrauterine hypoxia—ischemie injury[J].Sichuan Da Xue Xue Bao Yi Xue Ban，2004.35（3）：354—357.