結直腸癌患者腫瘤組織及血清ADAM10的表達

鄭佳，盛顯倉（臺州市第一人民醫院　消化內科，浙江　臺州　318020）

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結直腸癌患者腫瘤組織及血清ADAM10的表達

鄭佳，盛顯倉
（臺州市第一人民醫院消化內科，浙江臺州318020）

[摘 要]目的：檢測結直腸癌患者腫瘤組織和血清中解離素金屬蛋白酶10（ADAM10）的表達，分析其與結直腸癌發生、發展及臨床病理特征間的聯系。方法：應用免疫組織化學SP法檢測59例結直腸癌組織、30例結直腸息肉組織及30例正常對照人群腸黏膜中的ADAM10的表達情況，采用雙抗體夾心ELISA方法檢測上述3組人群血清中的ADAM10表達水平。結果：結直腸癌患者組織和血清中ADAM10的表達水平顯著高于結直腸息肉組和正常對照人群（P＜0.001）；伴隨著腫瘤Duke分期的增加，結直腸癌患者組織和血清中ADAM10表達水平進行性升高。癌組織和血清中的ADAM10表達水平和結直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織類型無關（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、腫瘤遠處轉移、Duke分期有關（P＜0.01）。

結論：ADAM10在結直腸癌患者癌組織和血清中高表達，且和結直腸癌的重要臨床病理特征相關，在結直腸癌的診斷中具有一定的臨床應用價值。

[關鍵詞]結直腸腫瘤；病理分析；解離素金屬蛋白酶10

結直腸癌是最常見的消化系統惡性腫瘤，其發生和個人遺傳、飲食、環境等諸多因素有關。在我國隨著生活習慣的改變，發病率日益增高。解離素金屬蛋白酶10（adisintegrin and metalloproteinase 10，ADAM10）是一種跨膜金屬蛋白，通過調節Notch[1]、上皮細胞型鈣黏蛋白、表皮生長因子、表皮生長因子受體2和炎性細胞因子等，參與腫瘤的形成，促進腫瘤的侵襲和轉移[2]。大量研究表明，ADAM10在肝癌、前列腺癌[3]、黑色素瘤[4]、結腸癌[5]和口腔鱗狀上皮細胞癌[6]等多種腫瘤中過表達，并在腫瘤的形成過程中起重要作用[7]。本研究通過檢測ADAM10在結直腸癌患者腫瘤組織和血清中的表達情況，探討其和臨床病理特征的關系，為進一步研究結直腸癌的發病機制、腫瘤治療、推測預后提供依據。

1　資料和方法

1.1 一般資料 收集結直腸癌患者59例，其中男39例，女20例，年齡38～89歲，平均（63.3±12.8）歲，所有患者術前均未行放化療，病理結果證實為結直腸癌。結直腸息肉患者30例，其中男18例，女12例，年齡25～79歲，平均（47.2±13.7）歲，病理結果證實為結直腸腺瘤性息肉。正常對照人群30例，其中男17例，女13例，年齡21～66歲，平均（41.2±10.4）歲，腸鏡檢查陰性，各項生化指標均正常。研究對象為2012年6月-2014年6月在臺州市第一人民醫院就診的門診、住院患者和健康體檢者。

1.2方法

1.2.1樣本采集：①組織采集：腸鏡檢查時采取新鮮的結直腸癌組織、腸息肉組織、正常腸黏膜組織，用4%甲醛溶液固定后保存待測；②血清采集：采用EDTA真空采血管分別抽取結直腸癌、結直腸息肉患者和正常健康對照者的靜脈血4 mL，以4 000 r/min離心15 min后分離血清，于-80 ℃保存待測。

1.2.2實驗方法：①免疫組織化學SP法檢測癌組織、結直腸息肉組織、正常腸黏膜組織中的ADAM10表達，組織標本進行石蠟包埋、切片、脫蠟、水化、枸櫞酸鹽抗原修復液高壓抗原修復；3%過氧化氫37 ℃溫箱孵育10 min，消除內源性過氧化物酶活性，滴加正常山羊血清37 ℃孵育10 min，滴加1:100的兔抗人ADAM10多克隆抗體，4 ℃冰箱過夜，滴加生物素標記的羊抗兔二抗，37 ℃濕盒孵育30 min，二氨基聯苯胺（3，3-diaminobenzidine，DAB）顯色劑顯色，自來水沖洗，蘇木素復染，1%鹽酸酒精酚化，脫水干燥，中性樹膠封片。以試劑盒中陽性切片作為染色的陽性對照，磷酸鹽緩沖液替代一抗為染色的陰性對照。②ELISA法檢測結直腸癌、結直腸息肉患者和正常健康對照者的血清ADAM10的表達水平，操作步驟按照試劑盒說明書進行。根據正常人群測定結果確定臨界值范圍（說明書提供），ADAM10 ＜150 pg/mL。ELISA試劑盒、兔抗人ADAM10多克隆抗體均購自上海晶美生物科技有限公司。

1.2.3結果判斷：ADAM10定位于細胞漿和胞膜，呈棕黃色細顆粒狀，胞核不染色，每張切片隨機選取3個高倍鏡視野，以陽性細胞比例的平均值定義為該腫瘤的陽性細胞百分比。細胞不著色為“-”；陽性細胞數＜25%為“+’’；陽性細胞數25%～75%為“++”；陽性細胞數＞75%為“+++”。以細胞漿或細胞膜出現棕黃色或棕褐色顆粒為陽性，染色的強弱以0～3表示，染色范圍以0～100表示，通過染色強度和染色范圍相乘得到染色積分（0～300），染色積分＞中位數為高表達。免疫組織化學結果由2位病理科醫師分別采取雙盲閱片判定。

1.3統計學處理方法 采用SPSS13.0軟件進行統計學分析，用Excel制作統計圖，計量資料用±s表示，組間率的比較采用x2檢驗。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1結直腸癌患者血清中ADAM10的表達 結直腸癌患者組ADAM10血清平均濃度為（347.4±32.2）pg/ mL，顯著高于結直腸息肉組（178.3±14.2）pg/mL和正常對照人群（82.6±10.6）pg/mL（P＜0.01），見圖1。結直腸癌患者Duke A、B、C、D期患者血清ADAM10水平分別為（195.4±18.6）pg/mL、（267.1± 27.8）pg/mL、（322.9±29.5）pg/mL、（390.6± 30.8）pg/mL。伴隨著腫瘤Duke分期的增加，結直腸癌患者血清ADAM10水平進行性升高，Duke分期A、B、C、D 4期比較差異具有統計學意義（P＜0.01），見圖2。

圖1　結直腸癌、結直腸息肉、正常對照人群血清ADAM10水平

圖2　結直腸癌Duke A、B、C、D 4期血清ADAM10水平

2.2結直腸癌患者組織中ADAM10的表達 ADAM10主要表達于細胞胞漿和胞膜，細胞間質不染色，見圖3a。ADAM10在結直腸癌中表達陽性率為77.97%，在結直腸息肉組織中及正常腸黏膜組織中表達陽性率分別為10%和6.6%，結直腸癌組織中的ADAM10的陽性率顯著高于結直腸息肉組和正常對照組，差異有統計學意義（P＜0.01）。伴隨著結直腸癌患者腫瘤分期的增加，結直腸癌患者腫瘤組織中ADAM10表達陽性率也進行性上升，差異具有統計學意義（P＜0.01）。見表1。

2.3血清及腫瘤組織中ADAM10表達與臨床病理特征的關系 結直腸癌患者血清及腫瘤組織中的ADAM10表達與結直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織類型無相關性（P＞0.05）；而與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、腫瘤遠處轉移、Duke分期有相關性（P＜0.01）。見表1。

圖3　ADAM10在結直腸癌及正常腸黏膜中的表達（SP法，×400）

表1　結直腸癌患者血清ADAM10水平及腫瘤組織中ADAM10的表達與臨床病理特征的關系

3　討論

ADAM10具有獨特的結構和生物功能，成為近年來研究的熱點，其屬于跨膜金屬蛋白酶，具有4個功能區域：蛋白水解域、粘連域、融合域和胞內信號域，在很多惡性腫瘤中高度表達，和腫瘤細胞的復制、侵襲、浸潤過程有緊密的聯系[8-9]。研究證實ADAM10的過表達能促進口腔鱗狀細胞癌[10]和胃癌的生長，同樣發現通過干擾ADAM10使之表達下調可使腫瘤細胞減緩增殖，所以ADAM10被認為是腫瘤治療的新的潛在靶點[6，11]。

本研究發現，結直腸癌患者的血清ADAM10表達水平顯著高于結直腸息肉組和正常對照人群。伴隨著腫瘤Duke分期的增加，結直腸癌患者血清ADAM10水平進行性升高，差異具有統計學意義。采用免疫組織化學方法檢測結直腸癌組織、結直腸息肉組織及正常腸黏膜組織中的ADAM10的表達水平，結果顯示，結直腸癌組織中的ADAM10表達陽性率顯著高于結直腸息肉組和正常腸黏膜組，提示ADAM10可能參與了從正常-腺瘤-癌的整個結直腸癌的演變過程。免疫組織化學發現ADAM10表達主要在細胞漿和胞膜，細胞間質不染色，進一步證實了ADAM10是一種跨膜蛋白，ADAM10通過對跨膜蛋白的蛋白水解、釋放胞外域的作用，并且還可和許多信號分子和黏附分子等相互作用，參與腫瘤的發生、發展、浸潤的過程。由此，我們推測血清中的ADAM10表達水平和組織中的ADAM10表達水平密切相關，ADAM10表達水平越高，侵襲性越強。結直腸癌細胞通過大量表達ADAM10來水解細胞外基質來促進癌細胞的侵襲、浸潤。Murai等[12]在人膠質母細胞瘤U251研究中表明，ADAM10能裂解黏附分子CD44，促進細胞的遷移和侵襲。Schulz等[13]證實ADAM10有水解細胞外膠質IV型胎盤膠原的作用，推測其可能參與癌細胞的侵襲和擴散。Fogel等[14]發現在卵巢癌和子宮癌中，ADAM10介導黏附分子L1釋放，增強細胞遷移和腫瘤播散。Gavert等[5]研究表明ADAM10的過表達可以增強結直腸癌細胞的內源性L1-CAM的斷裂和誘導肝轉移，同時也可以提高恒定轉染L1-CAM的結腸癌細胞轉移能力。而本實驗中我們發現結直腸癌患者血清ADAM10表達水平伴隨著腫瘤分期的增加而進行性升高，進一步提示ADAM10在腫瘤的生長、浸潤、轉移過程中起到重要作用。結直腸癌患者血清及腫瘤組織中的ADAM10表達和結直腸癌患者的性別、年齡、腫瘤部位、腫瘤大小、組織類型無關（P＞0.05），而與腫瘤的分化程度、淋巴結轉移、腫瘤遠處轉移、Duke分期有關（P＜0.01），由此我們可以推測ADAM10的高表達和結直腸癌的預后密切相關，可以作為預后的指標。

本研究發現ADAM10在結直腸癌患者血清及組織中高表達，而在正常組織中極低表達，有潛力作為一種新的腫瘤標志物，如果能夠以調控ADAM10的表達為目標，抑制腫瘤細胞的轉移和侵襲，有希望為結直腸癌的靶向治療提供新的思路。

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（本文編輯：吳彬）

·臨 床 經 驗·

·論著·

Study on the expression of ADAM10 in colorectal cancer tissues and serum

ZHENG Jia,SHENG Xiancang.
Department of Gastroenterology,Taizhou First People’s Hospital,Taizhou,318020

Abstract:Objective:To detect the expression of ADAM10 in colorectal cancer tissue and serum,analyze the relationship between colorectal cancer occurrence,development,and clinical pathological characteristics.Methods:Samples of 59 colorectal cancer tissues,30 colorectal polyps tissues and 30 health human of normal intestinal mucosa tissue were collected to detect the expressions of ADAM10 with immunohistochemistry SP.ADAM10 expression in serum of the above three groups was detected with double antibody sandwich ELISA method.Results:The expression level of ADAM10 in serum and tissue in the colorectal cancer patients was significantly higher than that in colorectal polyps groups and normal control groups (P＜0.001).ADAM10 expression levels were elevated in serum and tissue of the colorectal cancer patients with the increase of tumor Duke stage.The expression level of ADAM10 in serum and tissue of the colorectal cancer patients was no relationship with the sex,age,the location of the tumor,tumor size,histological type (P＞0.05),and was correlated with the tumor differentiation,lymphoid node diversion,distant metastasize,Duke stage (P＜0.01).Conclusion:Colorectal cancer patients has higher expression of ADAM10 in cancer tissue and serum,and related with clinical pathological characteristics of colorectal cancer.It has a certain clinical value in the diagnosis of colorectal cancer.

Key words:colorectal neoplasms; athological analysis; adisintegrin and metalloproteinase 10

作者簡介：鄭佳（1980-），女，浙江臺州人，主治醫師，碩士。

基金項目：臺州市黃巖區科技計劃項目（2011062-3）。

收稿日期：2015-04-22

[中圖分類號]R735.3

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.008