MIF基因多態性與剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥遺傳易感性相關性研究

林蓉蓉，谷杭芝，周星星，鄭飛云（.溫州醫科大學　第一臨床醫學院，浙江　溫州　505；.溫州醫科大學附屬第一醫院　婦科，浙江溫州　505；.溫州醫科大學附屬第一醫院　檢驗科，浙江　溫州　505）

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MIF基因多態性與剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥遺傳易感性相關性研究

林蓉蓉1，谷杭芝2，周星星3，鄭飛云2
（1.溫州醫科大學第一臨床醫學院，浙江溫州325035；2.溫州醫科大學附屬第一醫院婦科，浙江溫州325015；3.溫州醫科大學附屬第一醫院檢驗科，浙江溫州325015）

[摘 要]目的：研究巨噬細胞移動抑制因子（MIF）啟動子上游的rs2012133G/C、rs4822443A/G和rs4822446G/A位點基因多態性與剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥易感性的關系。方法：收集60例經病理確診的剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥患者作為病例組，同期選取109例健康志愿者作為對照組，采用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性（PCR-RFLP）方法對MIF基因多態性進行分析，分析基因型的分布及其與剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥發病風險的關系。結果：rs2012133G/C SNP的CC、CG、GG基因型頻率在病例組和對照組2組中比較差異有統計學意義（P=0.032）；C、G等位基因頻率分布2組比較差異有統計學意義（P= 0.031）。與CG+CC基因型相比，攜帶GG基因型可明顯增加子宮內膜異位癥的發病風險（OR=2.284，95%CI：1.200～4.345）。而rs4822443A/G、rs4822446G/A SNP的基因型頻率在病例組和對照組中的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。結論：MIF rs2012133G/C位點基因多態性與剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥發生的易感性有關，GG基因型是子宮內膜異位癥的易感基因型。

[關鍵詞]子宮內膜異位癥；巨噬細胞移動抑制因子；基因多態性；剖宮產

子宮內膜異位癥為婦科常見疾病，傳統上將其分為卵巢型、腹壁型和深部浸潤型。近年來無產科指征剖宮產及社會因素剖宮產逐年增加，剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥發病率也呈上升趨勢，逐漸引起婦產科醫師的重視。巨噬細胞移動抑制因子（macrophage migration inhibitory factor，MIF）是一種可溶性淋巴因子。已有研究證實MIF水平在子宮內膜異位癥患者的外周血及腹腔液中呈明顯升高的趨勢[1]。MIF基因多態性在子宮內膜異位癥中已有研究[2-4]，而MIF基因啟動子上游的rs2012133G/C、rs4822443A/G和rs4822446G/A位點的基因多態性與剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥的關系尚未見報道，故本研究擬用聚合酶鏈式反應-限制性片段長度多態性分析（PCR-RFLP）技術，探討MIF基因多態性與剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥易感性的關系，進一步闡明剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥發生的分子機制。

1　資料和方法

1.1一般資料 選取2015年1月至2015年7月溫州醫科大學附屬第一醫院婦科收住的剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥患者共60例為病例組，年齡24～44歲，平均（33.48±6.93）歲。最短發病年齡為剖宮產術后4個月，最長為剖宮產術后5年。所有病例術后病理診斷為腹壁子宮內膜異位癥。隨機選取同時期本院109例健康體檢者為對照組，年齡22～50歲，平均（31.25±7.17）歲，2組間年齡差異無統計學意義（P＞0.05）。2組受試者彼此之間無血緣關系，家族史中無遺傳病，無肝炎、結核等感染性疾病，無糖尿病、甲狀腺功能異常等內分泌疾病，無婦科良、惡性腫瘤，無類風濕性關節炎及其他自身免疫性疾病，3個月內未服用過激素類藥物。對照組均通過腹部B超檢查及外周血CA125測定，排除腹壁子宮內膜異位癥、盆腔子宮內膜異位癥及子宮腺肌病。以上標本采集均由受試者本人及其家屬知情同意。

1．2方法

1．2．1 DNA提取：清晨空腹條件下抽取2組受試者外周靜脈血3 mL，加入內置有0.85 mL枸櫞酸鈉的試管中，使用天根血液基因組DNA提取試劑盒提取外周血白細胞DNA。

1．2．2 基因多態性檢測：MIF-rs2012133G/C、rs4822443A/G和rs4822446G/A基因型檢測采用PCRRFLP方法。PCR反應體積為20 μL，其中模板DNA 1 μg，2X Taq PCR Mastermix 10 μL（北京天根生化科技有限公司），primer1（10 μmol/L）1 μL，primer2（10 μmol/L）1 μL（所有引物均由primer premier 5.0設計，由上海生工生物工程有限公司合成，引物及退火條件見表1），雙蒸水補足至20 μL；酶切反應體系10 μL，其中PCR產物4 μL，限制性內切酶（北京NEB有限公司）0.2 μL，10X NEBuffer 1 μL，雙蒸水補足至10 μL，37 ℃水浴4 h。酶切產物于2%的瓊脂糖凝膠電泳分析基因型。通電，穩壓110 V，電泳以溴酚藍指示劑至膠2/3處停止。

表1　各基因位點的引物、退火條件、產物長度、內切酶種類及酶切后片段長度

1．3統計學處理方法 采用SPSS19.0統計軟件進行分析。計量資料采用t檢驗，計數資料采用卡方檢驗，以非條件logistic回歸方法計算等位基因和基因型相對風險度的比值比（odds ratio，OR）及其95%可信區間（confidence interval，CI）。P＜0.05為差異有統計學意義。

2　結果

2.1酶切結果 rs2012133G/C位點GG基因型不能被HpaII酶切，只可見一條793 bp大小的條帶，而CC基因型被HpaII酶切后可見一條209 bp和一條584 bp大小的條帶，GC基因型同時見上述三條條帶。rs4822446G/A位點GG基因型不能被AluI酶切，只可見一條326 bp大小的條帶，而AA基因型被AluI酶切后可見一條200 bp和一條126 bp大小的條帶，GA基因型同時見上述三條條帶。rs4822443A/G位點AA基因型不能被HaeIII酶切，只可見一條326 bp大小的條帶，而GG基因型被HaeIII酶切后理論上將會有一條298 bp和一條38 bp大小條帶，但38 bp的條帶在瓊脂糖凝膠上電泳速度過快，所以在最終曝光的結果中并不能見到清楚的38 bp條帶，所以GG基因型被HaeIII酶切后可見到一條略低于326 bp的298 bp大小的條帶，AG基因型同時見上述兩條條帶。見圖1。

2.22組研究對象Hardy-Weinberg平衡檢驗 統計學處理顯示2組MIF-rs2012133G/C、rs4822443A/G 和rs4822446G/A基因型位點的基因型頻率分布均符合Hardy-Weinberg平衡（均P＞0.05）。

2.32組間多態性位點基因型、等位基因頻率比較

rs2012133G/C SNP的CC、CG、GC基因型頻率在病例組和對照組中分別是20.0%、25.0%、55.0%和 23.9%、41.3%、34.9%，2組比較差異有統計學意義（P=0.032）；C、G等位基因頻率分布在病例組和對照組中分別是32.5%、67.5%和44.5%、55.5%，2組比較差異有統計學意義（P=0.031）。使用logistic回歸分析計算結果顯示，與CG+CC基因型相比，攜帶GG基因型可明顯增加子宮內膜異位癥的發病風險（OR=2.284，95%CI：1.200～4.345）。rs4822443A/ G和rs4822446G/A SNP的基因型頻率在病例組和對照組患者中的比較，差異無統計學意義（P＞0.05）。見表2。

圖1　rs2012133G/C、rs4822446G/A及rs4822443A/G位點酶切產物電泳圖

表2　2組研究對象3個基因位點基因型及等位基因頻率比較[n（%）]

3　討論

剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥是一種特殊類型的盆腔外子宮內膜異位癥。隨著剖宮產率的逐年增加，其發生率也在不斷增高。一般認為剖宮產瘢痕子宮內膜異位癥系活性的子宮內膜種植于腹壁剖宮產部位而產生的，屬醫源性種植[5]。但在實際觀察中發現，剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥的發生率遠低于剖宮產切口污染率，可見該疾病發生與否并不完全由內膜種植所致。近年來的大量研究發現，免疫調節異常參與子宮內膜異位癥的發生發展，免疫機制在異位內膜的種植、定位、增殖及生長過程中起了很大的作用。子宮內膜異位癥患者體內大量細胞因子分泌失調（包括數量及活性的改變），它們相互之間形成了正反饋，使體內的無菌性炎癥反應大大增加，導致子宮內膜異位癥的發生及發展。因此，可以把子宮內膜異位癥看作是一種免疫缺陷導致的炎癥相關性疾病。

目前已有較多研究將關注點聚焦于MIF，其在子宮內膜異位癥發病中的作用已日益受到重視。MIF是一種可溶性的細胞因子，人的MIF基因片段長度小于1 kb，位于22號染色體長臂（22ql1.2）的保守區內，由3個外顯子和2個內含子組成[6]。研究發現子宮內膜異位癥患者的異位病灶中和外周血中MIF水平明顯升高[1]。雌激素能刺激異位子宮內膜細胞分泌MIF，而MIF又能反過來刺激雌激素合成過程中的關鍵酶—芳香化酶的表達，MIF在環路中起到了關鍵作用[7]。檢測子宮內膜異位癥患者腹腔液中的MIF水平發現，與對照人群比較其明顯升高[8]。早期的研究發現腹腔中的MIF主要由腹腔巨噬細胞分泌[9]，進一步的研究發現子宮內膜異位癥患者腹腔的巨噬細胞活性也發生了明顯的改變，其MIF的基礎分泌量和脂多糖刺激分泌量都較正常人多[10]。而在癌癥和其他炎癥性疾病領域對MIF的研究中發現，MIF不僅參與感染、自身免疫性疾病的病理生理過程，還可通過刺激細胞增殖和遷移[11]、促進血管生成[12]、影響腫瘤抑制基因p53轉錄活性[13]、抑制細胞周期蛋白G1[14]等影響腫瘤的發生和發展。MIF的作用似乎都涉及到了子宮內膜異位癥形成的過程中的3A程序—黏附、侵襲、血管形成[15]。MIF在子宮內膜異位癥無菌性炎癥中可通過抑制局部巨噬細胞和單核細胞的移行，促進其在炎癥部位的聚集、浸潤、增殖，增強其吞噬功能，并可促進血管內皮生長因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）的釋放[16]。VEGF是內皮細胞的特異性絲裂原，是目前已知的作用最強的促血管生成因子之一，同時也是一種有效的血管通透性誘導因子[17]。目前已有大量的研究表明在子宮內膜異位癥的發病過程中VEGF是一個重要的因子。在早期子宮內膜異位盆腔囊腫形成的過程中，聚集了更多的VEGF[18]，小鼠造模過程中形成的子宮內膜異位癥病灶組織中，VEGF及其受體的表達明顯升高[19]。早期的研究發現，腹腔中的VEGF也可以來源于巨噬細胞[20]。這些炎癥因子之間構成了一個復雜的網絡關系。但關于子宮內膜異位癥患者體內高表達MIF的始發因素，目前仍未見相關報道。

本文將MIF基因啟動子區的MIF-rs2012133G/C、rs4822443A/G和rs4822446G/A三個SNP位點納入研究，結果發現rs2012133G/C位點中攜帶GG基因型的女性剖宮產術后腹壁子宮內膜異位癥的發病風險增加（OR=2.284），GG基因型是子宮內膜異位癥的易感基因型。推測rs2012133G/C位點中攜帶GG基因型的女性，其MIF基因啟動子的活性增強，從而增加MIF的表達進而促進異位內膜細胞在局部種植、黏附、浸潤、生長、病灶形成。而該位點突變的確切功能仍需進一步的實驗證明。

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（本文編輯：趙翠翠，丁敏嬌）

·消息·

Correlation study of single nucleotide polymorphisms in macrophage migration inhibitory factor gene with the risk of abdominal wall endometriosis after cesarean section

LIN Rongrong1,GU Hangzhi2,ZHOU Xinxin3,ZHENG Feiyun2.1.First Clinical Medical College,Wenzhou Medical University,Wenzhou,325035; 2.Department of Gynecology,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015; 3.Department of Clinical Laboratory,the First Affiliated Hospital of Wenzhou Medical University,Wenzhou,325015

Abstract:Objective:To investigate whether polymorphisms of macrophage migration inhibitory factor (MIF) in promoter region (rs2012133G/C,rs4822443A/G and rs4822446G/A) are associated with hereditary susceptibility of abdominal wall endometriosis after cesarean section.Methods:Sixty patients with abdominal wall endometriosis after cesarean section were selected as case group and 109 healthy volunteers were collected as control group.The genotypes were detected by polymorphism chain reaction and restriction fragment length polymorphism analysis (PCR-RFLP).Results:There were statistical differences in genotype frequencies and allele frequencies between the case group and the control group (P=0.032; P=0.031) in rs2012133G/C site,GG genotype may markedly increase the risk of abdominal wall endometriosis after cesarean section (OR=2.284,95%CI:1.200～4.345).While no significant statistical differences could be found in rs4822443A/G,rs4822446G/ A sites (P＞0.05).Conclusion:The results suggest that MIF rs2012133G/C polymorphism is associated with abdominal wall endometriosis after cesarean section,GG genotype is the risk genotype.

Key words:endometriosis; macrophage migration inhibitory factor; polymorphism; cesarean section

通信作者：鄭飛云，主任醫生，教授，博士生導師，Email：zfy 5710@163.com。

作者簡介：林蓉蓉（1990-），女，浙江溫州人，碩士生。

基金項目：浙江省臨床醫學重中之重一級學科開放基金（447201 206/002）；溫州市科技局科研基金資助項目（Y20140125）。

收稿日期：2015-12-09

[中圖分類號]R711.71

[文獻標志碼]A

DOI:10.3969/j.issn.2095-9400.2016.03.005