X射線對BGC-803胃癌細胞凋亡及Survivin蛋白表達的影響

任振泰　王曉瑜

(鄭州大學第五附屬醫院 放療科　河南 鄭州　450052)

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X射線對BGC-803胃癌細胞凋亡及Survivin蛋白表達的影響

任振泰王曉瑜

(鄭州大學第五附屬醫院 放療科河南 鄭州450052)

【摘要】目的分析X射線對BGC-803胃癌細胞凋亡及Survivin蛋白表達的影響。方法將BGC-803胃癌細胞分為對照組、實驗組；實驗組分別給予1、2、5 Gy X射線照射。流式細胞儀檢測各組細胞凋亡及Survivin蛋白表達情況。結果隨著X射線劑量增大，BGC-803細胞凋亡率增大；在2 Gy、5 Gy組，隨X射線照射時間延長，細胞凋亡率增大，而1 Gy組無明顯改變。大劑量(5 Gy)X射線引起BGC-803胃癌細胞Survivin蛋白表達增加，而小劑量X射線(1 Gy、2 Gy組)對BGC-803胃癌細胞Survivin蛋白表達無顯著影響。結論X線輻射引起BGC-803胃癌細胞凋亡具有輻射劑量、時間依賴性；大劑量X射線照射使Survivin蛋白表達增加，可能與細胞周期、DNA同源重組修復有關。

【關鍵詞】胃癌；X射線；Survivin蛋白

胃癌是最常見的惡性腫瘤之一，我國發病數及死亡數均位于第3位[1]。手術是胃癌的主要治療手段。早診斷、早手術是有效提高患者預后的因素[2]，晚期胃癌的5年生存率很低[3]。局部復發和遠處轉移是胃癌術后失敗的主要原因。為提高胃癌治療療效，圍手術期綜合治療顯得尤為重要，單純或者輔助放射治療越來越受到重視。Survivin基因作為凋亡抑制家族的一員，主要作用為抑制細胞凋亡、干擾細胞周期、促進細胞分裂和增殖、促進血管生成等[4-8]。Survivin蛋白特異性高表達與腫瘤的惡性程度、遠處轉移、預后不良呈正相關。有研究認為，其高表達與放射治療敏感性也有關系[9]。本研究擬通過體外實驗對BGC-803胃癌細胞X線外照射，觀察細胞凋亡、Survivin 蛋白表達情況，并分析它們之間的關系，為動物實驗或臨床實驗提供依據。

1材料與方法

1.1細胞株與試劑BGC-803胃癌細胞購于協和細胞室，RPMI-1640培養基、胎牛血清購自美國GIBCO公司， 兔IgG多抗購自美國Santa Cruz公司，標記山羊抗兔IgG、山羊血清購自中國北京中杉公司，碘化丙啶購自美國Sigma公司。

1.2實驗方法實驗分為對照組和實驗組(照射劑量1、2、5 Gy)，每組設4個復孔。將對數生長期的BGC-803胃癌細胞懸液接種到24孔板，細胞濃度為1×105個/孔，培養24 h，室溫下進行X射線垂直照射，不同組照射劑量分別為1、2、5 Gy。放射線照射后分別于0、2、4、6 h終止培養。

1.2.1照射方法采用美國Varian Clinac 23EX直線加速器，6MV-X線照射，源皮距100 cm，劑量率3 Gy/min，1.5 cm組織補償膠遮擋。

1.2.2細胞凋亡檢測終止培養后去培養液，以0.25%的胰酶消化貼壁細胞，吹打混勻形成單細胞懸液。收集細胞，PBS洗滌兩次(離心2 000 rpm，5 min)，后配置成濃度為5×105cell/ml的單細胞懸液，將懸液移液至離心管，1 000 rpm，4 ℃離心10 min，棄上清；加入500 μl的Binding Buffer，輕輕吹打混勻為混懸細胞液；加入5 μl Annexin V-FITC輕輕混勻；加入5 μl PI，混勻；室溫下避光反應，在1 h內上機檢測。獨立重復3次。用Modfit軟件分析細胞凋亡，結果以百分率表示。

1.2.3Survivin蛋白檢測終止培養后去培養液，以0.25%的胰酶消化貼壁細胞，吹打混勻形成單細胞懸液。收集細胞，PBS洗滌兩次(離心2 000 rpm，5 min)，后配置成濃度為5×105cell/ml的單細胞懸液。特異組加Survivin兔IgG多抗50 μl(非特異組加50 μl PBS)，4 ℃條件下作用45 min；加入封閉山羊血清50 μl，4 ℃反應30 min，PBS洗滌2次；加入FITC標記山羊抗兔IgG 50 μl，4 ℃反應45 min。PBS洗滌兩次后上機檢測，利用Cell Quest軟件分析。Survivin蛋白表達=特異組陽性百分數-非特異組陽性百分數。獨立重復3次。

1.3統計學方法采用SPSS 15.0數據分析軟件包完成數據處理及統計分析，多組樣本均數的比較使用One-Way ANOVA。P<0.05為差異有統計學意義。

2結果

2.1X射線對BGC-803胃癌細胞凋亡的影響1 Gy照射組細胞凋亡差異無統計學意義(P>0.05)；4 h與6 h時間點隨X射線劑量增大，BGC-803胃癌細胞凋亡率增大，差異有統計學意義(P<0.05)；隨觀察時間延長，2 Gy組及5 Gy組細胞凋亡率增大，差異有統計學意義(P<0.05)。X射線對BGC-803胃癌細胞凋亡率具有輻射劑量、時間依賴性。見表1。

表1　X射線對BGC-803胃癌細胞凋亡率的影響

注：與對照組比較，aP<0.01；與1 Gy組、2 Gy組同時間點比較，bP<0.01；組內與0 h及2 h時間點比較，cP<0.01。

2.2X射線對BGC-803胃癌細胞Survivin蛋白表達的影響小劑量(1、2 Gy)X射線對BGC-803胃癌細胞survivin蛋白表達無影響(P>0.05)；大劑量(5 Gy)X射線引起BGC-803胃癌細胞survivin蛋白表達增加(P<0.05)。見表2。

表2　 X射線對BGC-803胃癌細胞Survivin

注：與對照組、1 Gy組、2 Gy組比較，dP<0.01；組內與0 h時間點比較，eP<0.01。

3討論

胃癌是最常見的消化道惡性腫瘤之一，其發生是受多因素影響的復雜病理過程，主要表現為細胞增殖失控、分化障礙、凋亡受阻。臨床確診時，大部分胃癌已經處于進展期。對于進展期或術后復發患者，沒有特效治療方案，預后較差。腫瘤細胞的過度增生、凋亡抑制在胃癌惡化進展過程中發揮著重要作用。如何控制胃癌惡化進展已經成為臨床亟待解決的問題。Survivin基因在胃癌組織中高表達已得到證實，而正常胃黏膜組織無表達[10]。Survivin作為凋亡抑制因子，其高表達預示著癌癥進展以及預后不良，影響了放射治療的敏感性[11-12]。研究細胞Survivin蛋白表達與放射治療以及細胞凋亡的關系，對于指導惡性腫瘤的治療具有重要意義。

本研究中，不同劑量X射線照射BGC-803胃癌細胞后，細胞凋亡率具有劑量、時間依賴性，表現為隨照射劑量增大、時間延長，細胞凋亡率增大。大劑量(5 Gy)X射線輻射BGC-803胃癌細胞引起Survivin蛋白表達增加。本實驗表明，X線輻射導致BGC-803胃癌細胞高凋亡率的同時伴有Survivin蛋白高表達。考慮以下原因：放射生物學認為，有絲分裂期細胞或接近有絲分裂期，即G2/M期細胞是放射最敏感細胞，易引起輻射凋亡[13]；在整個細胞周期中Survivin蛋白高表達主要在G2期或者Survivin使細胞周期阻滯在G2/M期；Survivin蛋白高表達G2期BGC-803胃癌細胞，容易引起輻射誘導的凋亡。染色體DNA是X射線輻射引起細胞凋亡的靶位；DNA受到輻射損傷，特別是亞致死性損傷后，具有自我損傷修復能力；高表達的Survivin蛋白抑制細胞凋亡。本實驗中凋亡率與Survivin蛋白表達呈正相關，考慮Survivin基因與DNA損傷后的同源重組修復有關[14]。

放射生物學認為，放射敏感腫瘤常常是低分化、高惡性腫瘤，受到輻射后易引起輻射凋亡[13]。體外細胞實驗結果提示，Survivin蛋白高表達容易輻射凋亡。但是艾秀清等[12]通過臨床實驗提示，Survivin蛋白低表達增加了放射治療的敏感性，Survivin蛋白高表達組細胞凋亡指數低。這與本研究以及經典的放射生物學理論不同。這種差異考慮以下原因：體內、體外實驗標本差異；放射治療前的化療對Survivin蛋白表達有影響；本研究觀察終止時間為X線輻射后6 h；細胞受到輻射后喪失克隆能力，進行有限的幾次有絲分裂，高表達Survivin蛋白參與了損傷修復、抑制凋亡。具體原因需要實驗進一步驗證。

總之，X線輻射引起BGC-803胃癌細胞凋亡具有輻射劑量、時間依賴性，伴有Survivin蛋白高表達，可能與細胞周期、同源重組修復有關，為下一步實驗或者探討二者機制提供了方向。

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Effects of X-ray on apoptosis of BGC-803 gastric cancer cell and expression of Survivin protein

Ren Zhentai, Wang Xiaoyu

(DepartmentofRadiotherapy,theFifthAffiliatedHospitalofZhengzhouUniversity,Zhengzhou450052,China)

【Abstract】ObjectiveTo observe the effects of X-ray on apoptosis of BGC-803 gastric cancer cells and expression of Survivin protein. MethodsThe BGC-803 gastric cancer cells were divided into control group and experimental groups(radiation doses were 1、2、5 Gy, respectively). Apoptosis of BGC-803 gastric cancer cells and expression of Survivin protein were detected by flow cytometry. ResultsThe apoptosis rate of BGC-803 cancer cells was increased accompanied by the increase of X-ray dose. The apoptosis rate of BGC-803 cancer cells in 2、5 Gy groups was increased with the passage of time, but there was no chage in 1 Gy group. Low dose(1、2 Gy) of X-ray had no effect on the expression of Survivin protein, but 5 Gy group had increased the expression. ConclusionThe apoptosis of BGC-803 cancer cells was induced by X-ray in a dose- and time-dependent manner. High dose X-ray increased the expressiong of Survivin protein. It may be associated with DNA repair by homologous recombination or cell cycle.

【Key words】gastric cancer; X-ray; survivin proteitn

(收稿日期：2015-12-28)

【中圖分類號】R 735.2

doi:10.3969/j.issn.1004-437X.2016.03.004

通訊作者：任振泰，E-mail：rdf_zzu@126.com。