熒光PCR法檢測妊娠孕晚期婦女B族鏈球菌感染的應用價值

馬勇?李莉

【摘要】 目的 通過幾種方法對比檢測B族鏈球菌（GBS）， 探討熒光PCR法在產前篩查B族鏈球菌感染檢測中的臨床應用價值和意義。方法 采集臨床孕35～37周孕婦的陰道和直腸分泌物標本480例， 用熒光PCR法、細菌培養法及基因測序法同時檢測GBS， 并對結果進行分析。結果 熒光PCR法檢測GBS陽性75例， 陽性率為15.6%；細菌培養法檢測GBS陽性40例， 陽性率為8.3%， 兩種方法檢測陽性率比較差異有統計學意義（P<0.01）。熒光PCR法與基因測序法檢測結果對比， 熒光PCR法檢測GBS正確率為93.3%（70/75）， 靈敏度為100.0%（70/70）， 特異性為98.8%（405/410）。結論 熒光PCR法檢測GBS明顯優于細菌培養法， 與金標準基因測序法比對， 其檢測準確率、靈敏度、特異性都較高， 是產前篩查GBS的最佳方法， 值得臨床推廣應用。

【關鍵詞】 B族鏈球菌；熒光PCR法；細菌培養；基因測序

DOI：10.14163/j.cnki.11-5547/r.2016.10.062

B族鏈球菌（GBS）學名無乳鏈球菌（S.agalactiac）， 正常寄居于生殖道和直腸， 是一種條件致病菌。在美國25%～40%的孕婦產道攜帶GBS， 其中有一半會傳染給新生兒， 已被證實為圍生期婦女及新生兒感染的主要致病菌之一[1]。在我國GBS的產前篩查也越來越受到重視。本文主要探討熒光PCR法檢測GBS的臨床應用， 并與細菌培養法， 基因測序法進行比對。對比觀察熒光PCR法檢測的陽性率、準確率、靈敏度和特異性。現報告如下。

1 資料與方法

1. 1 一般資料 收集本院2014年1～12月收治的孕周35～37周孕晚期的門診和住院孕婦陰道和直腸分泌物標本480例， 孕婦年齡18～41歲。

1. 2 標本采集 標本采集部位和方法陰道口上1/3處， 沿生殖道壁用無菌拭子輕輕旋轉取得分泌物；無菌拭子插入肛門括約肌上2～5 cm處， 沿直腸壁輕輕旋轉取得分泌物。將采集好的拭子放回無菌試管內， 密閉送檢。48 h內進行GBS的檢測。

1. 3 儀器和試劑

1. 3. 1 美國ABI7500 RESL-TIME PCR分析儀。

1. 3. 2 福建泰普生物科學有限公司， B族鏈球菌核酸檢測試劑盒[國食藥管械（準）字2001第3400250號]。

1. 3. 3 鄭州安圖生物有限公司生產的微生物培養基和生化微量反應管。

1. 3. 4 長沙長錦科技有限公司， ST-2000A型CO2培養箱。

1. 4 方法

1. 4. 1 熒光PCR檢測 標本處理：無菌拭子管中加入清洗緩沖液1 ml， 高速震蕩2 min， 擠干拭子， 標本懸液移至試管中， 13000 r/min離心5 min， 棄掉上清液， 沉淀物中在加1 ml清洗緩沖液， 13000 r/min離心5 min， 棄掉上清液。沉淀物用100 μl 三羥甲基氨基甲烷-乙二胺四乙酸（TE）緩沖液重懸， 加入10 μl內參照。提取固型物：高速震蕩5 min破碎細胞， 95℃干浴2 min， 冰浴5 min， 13000 r/min離心1 min， 上清液5 μl加入PCR反應管中， 進行PCR擴增檢測（37℃， 2 min；95℃， 2 min；95℃， 15 s；55℃， 45 s；40個循環）。

1. 4. 2 細菌培養檢測 將陰道和直腸分泌物標本接種在5%羊血培養基上， 分區劃線， 置于35℃， 5%～10% CO2培養箱中。進行24 h培養后， 根據菌落形態， 溶血情況， 可疑菌落涂片染色， 顯微鏡下觀察。在進行菌種鑒定試驗：觸酶試驗、桿菌肽試驗、溶血試驗、CAMP試驗、馬尿酸鈉水解試驗、膽汁溶解試驗、七葉苷試驗等。

1. 4. 3 基因測序檢測 標本中基因序列與編碼CAMP蛋白序列比對， 均存在B族鏈球菌特有的基因序列為陽性。送第三方鄭州金域醫學檢驗中心檢測。

1. 5 統計學方法 采用SPSS11.0統計學軟件對數據進行統計分析。計數資料以率（%）表示， 采用χ2檢驗。P<0.05表示差異具有統計學意義。

2 結果

2. 1 480例妊娠孕晚期婦女分泌物標本中熒光PCR法檢測GBS陽性75例， 陽性率為15.6%；細菌培養法檢測GBS陽性40例， 陽性率為8.3%， 兩種方法檢測GBS陽性率比較差異有統計學意義（P<0.01）。見表1。

2. 2 以基因測序法作為GBS檢測結果的金標準， 對熒光PCR法檢測結果進行復查比對， 熒光PCR法檢測GBS正確率為93.3%（70/75）， 靈敏度為100.0%（70/70）， 特異性為98.8% （405/410）。見表2。

3 討論

最早 GBS的檢測方法主要是傳統的細菌培養法及細菌培養后菌落的膠乳凝集試驗（LA）和協同凝集試驗（COA）。根據菌落特點、溶血性、顯微鏡下形態觀察及生化試驗來判定GBS。但該方法耗時長， 細菌培養需24～48 h， 操作繁瑣， 而且陰道和直腸的其他細菌生長抑制了GBS的繁殖， 培養難度高， 也不適合臨床大量樣本的篩查， 并且檢測的陽性率也較低。本研究陽性率只有8.3%。國內同行有報道細菌培養法陽性率只有5.2%、7.5%[2， 3]。近些年來熒光PCR檢測方法的普及， 利用不同種屬GBS的特異性核酸序列設計引物， 用熒光探針標記， 使用先進的PCR檢測儀， 可以實現快速（4 h內）、靈敏、高通量的GBS檢測， 適合臨床大規模樣本的篩查。本文中熒光PCR檢測陽性率達到15.6%。與國內一些學者報道熒光PCR法檢出陽性率11.8%、9.4%都高于細菌培養法[4， 5]。與金標準基因測序法比對， 熒光PCR法檢測GBS正確率為93.3%， 靈敏度為100%， 特異性為98.8%。與相關文獻報道的正確率89.5%、靈敏度100.0%、特異性99.6%接近。另外， GBS標本取材后受保存條件、環境溫度等因素的影響， GBS有部分死亡的可能， 而熒光PCR法可以檢測到死亡的GBS。而GBS死亡， 則細菌培養法就會培養陰性。美國疾病預防控制中心（CDC）最新版的《妊娠合并B族鏈球菌（GBS）感染防治指南》指出有25%～40%的孕婦產道中攜帶GBS， 其中40%～70%在分娩過程中會傳遞給新生兒， 大約有1%～3%的新生兒會感染， 其中5%會導致死亡。孕婦感染GBS臨床可表現出菌血癥、泌尿系統感染、胎膜感染、子宮內膜感染及產褥期感染。GBS感染引起胎膜早破和羊膜腔感染， 誘發早產率可高達60%[6]。

綜上所述， GBS對妊娠婦女危害嚴重， 因此及時進行產前篩查GBS顯得尤為重要。熒光PCR法在GBS的檢測上具有速度快、靈敏度高、特異性好、結果準確的特點， 顯著優于傳統的培養法， 且適用于大量人群的普篩及妊娠孕晚期婦女的產前篩查， 值得臨床推廣應用。

參考文獻

[1] 時春艷， 曲首輝， 楊磊， 等.妊娠晚期孕婦B族鏈球菌帶菌狀況的檢測及帶菌對妊娠結局的影響.中華婦產科雜志， 2010， 45（1）：12-16.

[2] 劉睿， 崔坤友， 劉文彬， 等.應用熒光定量PCR技術和細菌培養法檢測孕婦產前B族鏈球菌感染的對比分析.醫學前沿， 2014（3）：198-199.

[3] 何國才， 白清， 李高， 等.桂林地區孕晚期孕婦B族鏈球菌檢測及藥敏分析. 國際檢驗醫學雜志， 2013， 8（15）：2006-2007.

[4] 邊佳明， 丁媛媛， 楊凡， 等.拭樣增菌對實時熒光PCR法檢測孕婦B族鏈球菌感染的影響.現代檢驗醫學雜志， 2012， 1（6）： 102-103.

[5] 王麗， 葉巍， 馬杰.實時熒光PCR技術和細菌培養法檢測妊娠晚期孕婦定植B族鏈球菌感染臨床分析.國際檢驗醫學雜志， 2014， 8（16）：2220-2221.

[6] 李小梅， 李瑾， 袁敏智.用聚合酶鏈反應技術探討B群鏈球菌與胎膜早破的關系.河北醫學， 2011， 17（3）：300-302.

[收稿日期：2015-11-24]